Gerando uma vacina de vesícula de membrana externa de exibição multivalente

Abstract

Fonte: Feng, R., et al. Uma plataforma de vacina de nanopartículas "plug-and-display" baseada em vesículas de membrana externa exibindo o domínio de ligação ao receptor SARS-CoV-2. J. Vis. Exp. (2022).

Este vídeo demonstra um método para gerar vacinas de vesícula de membrana externa (OMV) com exibição multivalente. As células de mamíferos são transfectadas para expressar e secretar antígenos virais fundidos a um SpyTag e a uma etiqueta de poli-histidina. Esses antígenos são então purificados usando uma coluna de afinidade de ácido nitrilotriacético (Ni-NTA). O antígeno purificado é misturado com vesículas de membrana externa que expressam a proteína SpyCatcher (SC) ligada à superfície. Vários antígenos se ligam covalentemente aos SpyCatchers por meio de suas SpyTags (ST), criando OMVs que exibem o antígeno, servindo como uma vacina multivalente.

Protocol

1. Construção do plasmídeo

1. Insira a sequência SpyCatcher que codifica o DNA (Figura 1) em um plasmídeo pThioHisA-Cytolysin A (ClyA) resistente à ampicilina (consulte a Tabela de Materiais) entre os locais BamH I e Sal I para construir o plasmídeo pThioHisA ClyA-SC após um relatório publicado anteriormente.
2. Ligue o gene de fusão sintetizado do gene de fusão SpyTag-SARS-CoV-2 receptor-catch-binding domain (RBD)-polyhistidine tag (Histag) (Figura 1) em um plasmídeo pcDNA3.1 (ver Tabela de Materiais) entre os locais BamH I e EcoR I para construir o plasmídeo pcDNA3.1 RBD-ST após um relatório publicado anteriormente.

2. Preparação OMV-SC

1. Execute a transformação ClyA-SC seguindo as etapas abaixo.
   1. Adicione 5 μL de solução de plasmídeo pThioHisA ClyA-SC (50 ng/μL) a 50 μL de cepa competente BL21, sopre suavemente e deixe esfriar no gelo por 30 min.
   2. Colocar a solução durante 90 s em banho-maria a 42 °C e, em seguida, colocar imediatamente a solução misturada no gelo durante 3 min.
   3. Adicionar 500 μL de meio Luria-Bertani (LB) à suspensão bacteriana e, após misturar, cultivar a 220 rpm a 37 °C durante 1 h.
   4. Colocar toda a transformação em uma placa de ágar LB contendo ampicilina (100 μg/mL, ver Tabela de Materiais) e cultivar durante a noite a 37 °C.
      nota: Em experimentos subsequentes, a ampicilina foi mantida na mesma concentração no meio. Caso contrário, isso pode causar perda de plasmídeos nas bactérias.
2. Para a produção OMV-SC, execute as etapas abaixo.
   1. Isolar uma única colónia da placa (passo 2.1.4.) para 20 ml de meio LB (resistente à ampicilina) e cultivar durante a noite a 220 rpm a 37 °C.
   2. Inocular a solução bacteriana (a partir do passo 2.2.1.) em meio de 2 l, cultivar a 220 rpm, 37 °C durante 5 h até à fase logarítmica de crescimento (a DO₆₀₀nm situa-se entre 0,6 e 0,8).
   3. Quando a DO a 600 nm da solução bacteriana atingir 0,6-0,8, adicione isopropilbeta-D-tiogalactopiranosídeo (IPTG, ver Tabela de Materiais) para fazer a concentração final da solução bacteriana ser 0,5 mM e, em seguida, cultive durante a noite a 220 rpm a 25 ° C.
3. Realize a purificação OMV-SC.
   1. Centrifugue a solução bacteriana a 7.000 x g a 4 °C durante 30 min.
   2. Filtrar o sobrenadante com um filtro de membrana de 0,22 μm e, em seguida, concentrar-se com uma membrana de ultrafiltração de 100 kD ou uma coluna de fibras ocas (ver Tabela de Materiais).
   3. Filtrar o concentrado através de um filtro de membrana de 0,22 μm e, em seguida, centrifugá-lo a 150.000 x g a 4 °C durante 2 h utilizando uma ultracentrífuga (ver Tabela de Materiais) e rejeitar o sobrenadante com uma pipeta.
   4. Ressuspenda a precipitação com PBS e armazene-a a -80 °C. A solução pode manter a estabilidade a longo prazo a -80 °C.

3. Preparação do RBD-ST

1. Realize a transfecção RBD-ST seguindo as etapas abaixo.
   1. Selecione um sistema de expressão eucariótico apropriado (por exemplo, HEK293F) e cultive as células durante a noite a 130 rpm a 37 ° C após a recuperação.
   2. Adicione 20 μL de solução de HEK293F célula no contador de células automatizado (consulte a Tabela de Materiais), registre o número de células, ajuste a concentração para 1 x 106 células / mL e, em seguida, cultive as células a 130 rpm a 37 ° C por 4 h.
   3. Filtrar o plasmídeo RBD-ST através de um filtro de membrana de 0,22 μm e adicionar 300 μg de plasmídeos no meio de cultura celular (ver Tabela de Materiais) até que o volume final seja de 10 ml; agitar durante 10 s.
   4. Aqueça a polietilenimina (PEI, 1 mg / mL, consulte a Tabela de Materiais) a 65 ° C no banho-maria, misture 0,7 mL de PEI com 9,3 mL de meio de cultura celular e agite intermitentemente por 10 s.
      nota: Não agite a solução vigorosamente. Caso contrário, as bolhas resultantes podem afetar a eficiência da transfecção.
   5. Adicionar solução de plasmídeo à solução de PEI, agitar a mistura intermitentemente durante 10 s e incubar a 37 °C durante 15 min.
   6. Adicionar a mistura a 280 ml de meio de cultura celular e cultivar a 130 rpm a 37 °C durante 5 dias.
2. Execute a purificação RBD-ST.
   1. Centrifugue as células a 6.000 x g a 25 ° C por 20 min e use uma pipeta para coletar o sobrenadante.
   2. Encha a coluna com 2 mL de agarose Ni-NTA (consulte a Tabela de Materiais) e lave-a 3x com 3x PBS.
   3. Adicione imidazol (consulte a Tabela de Materiais) ao sobrenadante da célula para fazer a concentração final de 20 mM e carregue o sobrenadante da célula 2x.
   4. Adicionar 3 volumes de coluna (CV) de PBS contendo 20 mM de imidazol para lavagem e recolher a fração de lavagem.
   5. Eluição gradiente com 3 CV de PBS contendo concentrações baixas a altas (por exemplo, 0,3 M, 0,4 M, 0,5 M) de imidazol; eluir 2x para cada concentração.
   6. Use SDS-PAGE para identificar o RBD-ST em diferentes gradientes de concentração.

4. Bioconjugação e purificação OMV-RBD

1. Determine a concentração de proteína pelo método do ensaio de ácido bicinconínico (BCA) (ver Tabela de Materiais).
   1. Dilua em série a solução padrão de proteína de albumina de soro bovino (BSA) de 2 mg / mL para 0,0625 mg / mL, dilua o OMV-SC purificado e RBD-ST 10x e, em seguida, misture as soluções de trabalho BCA A e B (fornecidas no kit de ensaio) na proporção de 50: 1 (v / v).
   2. Adicionar solução proteica diluída (25 μL/alvéolo) e misturar com a solução de trabalho BCA (200 μl/alvéolo); incubar a 37 °C durante 30 min.
   3. Meça a absorbância (OD) a 562 nm de cada alvéolo e calcule a concentração de proteínas a partir da curva padrão.
2. Realize a bioconjugação de OMV-SC e RBD-ST seguindo as etapas abaixo.
   1. Misture OMV-SC e RBD-ST em PBS na proporção de 40:1 (p/p).
   2. Gire verticalmente para misturar a mistura durante a noite a 15 rpm a 4 °C.
      nota: Diferentes antígenos podem reagir em proporções diferentes. Pode-se tentar diferentes taxas de reação com base nas características do antígeno.

Results

Figura 1: Sequências de plasmídeos usadas no presente estudo.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ampicilina sódica	Sangon Biotech	A610028
Contador de células automatizado	Estrela de contagem	biotecnologia
Kit de quantificação de proteínas BCA	CWBio	CW0014S
Aparelho de eletroforese	Cavoy	Potência BV
Centrifugador de congelação de alta velocidade	Bioridge	H2500R
His-Tag mouse mAb	Tecnologia de sinalização celular	2366s
Imidazol	Sangon Biotech	A600277
Isopropil-D-tiogalactopiranosídeo	Sangon Biotech	A600118
Ni-NTA His-Bind Superfluxo	Qiagen	Rolamento 70691
Meio de cultura de células OPM-293	Opm biociências	81075-001
Plasmídeo pcDNA3.1 RBD-ST	Wuhan genecreat tecnologia biológica
Tampão fosfato salino	ZSGB-bio	ZLI-9061
Polietilenonimina Linear	Policiências	Rolamento 23966-1
Escada de proteína prestained	Thermo	Rolamento 26616
plasmídeo pThioHisA ClyA-SC	Wuhan genecreat tecnologia biológica
Sistemas de bancada Quixstand (coluna de fibra oca de 100 kD)	GE Healthcare
Buffer de carregamento SDS-PAGE (5x)	Beyotime	Pág. 0015
cloreto de sódio	Sangon Biotech	A100241
Instrumento de suspensão	Tecnologia da Vida	Misturador de Hula
Triptona	Oxóide	LP0042B
Ultracentrífuga	relha Beckman	XPN-100
Espectrofotômetro ultravioleta	Hitachi	U-3900
Extrato de levedura	Sangon Biotech	A610961