Um modelo de interposição aórtica de camundongo para estudar a rejeição vascular induzida por aloimunidade

Abstract

Fonte: Enns, W., et al. Modelo de camundongo de rejeição vascular induzida por aloimunidade e arteriosclerose de transplante. J. Vis. Exp. (2015).

Este vídeo demonstra um método para gerar um modelo de interposição aórtica de camundongo para estudar a rejeição vascular induzida por aloimunidade. Depois de colocar um camundongo doador anestesiado em decúbito dorsal, a aorta abdominal infrarrenal (AIA) é cuidadosamente isolada das estruturas circundantes. Os vasos ramificados são ligados e ambas as extremidades do AIA são pinçadas para evitar o fluxo sanguíneo antes da ressecção. Posteriormente, o IAA do doador é implantado em um camundongo receptor alogênico e o fluxo sanguíneo é restaurado por meio de anastomose para investigar a rejeição vascular induzida por aloimmune.

Protocol

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

Use camundongos doadores Balb/cYJ (H2^d) e camundongos receptores C57Bl/6 (H2^b) para examinar reações alogênicas. Os camundongos são usados para experimentos entre as idades de 8 a 12 semanas. Use camundongos fêmeas ou machos. Os controles singênicos consistem em segmentos aórticos de doadores C57Bl/6 em receptores C57Bl/6.

1. Preparação de doadores e receptores

NOTA: Tanto o doador quanto o receptor são anestesiados e preparados antes da cirurgia para minimizar a isquemia do enxerto. Anestésicos injetáveis são usados no protocolo para evitar a obstrução do animal por equipamentos necessários para a administração de anestésicos inalatórios. No entanto, se desejado, um anestésico inalatório é uma alternativa apropriada. Desde a injeção inicial dos anestésicos, todo o procedimento leva aproximadamente 90 min para ser concluído. O tempo isquêmico do enxerto é inferior a 30 min.

1. Anestesiar o camundongo com injeções intraperitoneais de cetamina (100 mg / kg; 10 mg / ml) e xilazina (10 mg / kg; 1 mg / ml). O mouse será sedado dentro de 10 a 15 minutos. Avalie a profundidade da anestesia beliscando a parte gordurosa da almofada do pé do animal. Administre 1/3 da dose original do coquetel anestésico, conforme necessário, até que o animal não apresente reflexo de abstinência. Monitore a frequência respiratória de perto após a administração de cada coquetel. Durante a cirurgia, avalie o nível de anestesia a cada 15 minutos, beliscando a parede abdominal anterior com uma pinça. Os camundongos devem permanecer profundamente anestesiados por 60 a 90 min.
2. Lubrifique os olhos do camundongo com uma pomada oftálmica para evitar o ressecamento durante a anestesia.
3. Raspe o cabelo o mais próximo possível da pele na região ventral abdominal, do meio do tórax ao púbis. Tenha especial cuidado para não cortar nenhuma pele. Não use creme depilatório, pois pode ser absorvido pela pele e pode ser inflamatório.
4. Coloque o animal em decúbito dorsal em uma toalha acima da mesa ou almofada de aquecimento.
5. Limpe o local da cirurgia com uma esfoliação preliminar com clorohexidina a 2%. Prepare uma grande área de trabalho para maximizar o campo cirúrgico. Comece a esfregar no centro do local da cirurgia e mova-se para fora linear ou circularmente. Descarte a gaze. Repita este procedimento pelo menos mais 5 vezes. Aplique uma almofada de preparação de álcool na mesma área. Assim que o álcool estiver seco, prepare a área limpa com solução de Betadine e cubra-a com gaze estéril.

2. Procedimento de Anastomose Término-Extremo

1. Operação de doadores
   1. Mantenha uma técnica asséptica durante toda a operação. Limpe todas as superfícies da bancada e da mesa cirúrgica com solução de peróxido de hidrogênio acelerado a 0.5% antes de usar. Enrole e autoclave todos os instrumentos cirúrgicos, gazes, cortinas e aventais antes de usar. Verifique a esterilidade dos instrumentos com uma tira indicadora de esterilizador a vapor colocada em cada embalagem. Luvas cirúrgicas estéreis são usadas e descartadas entre as cirurgias. Para cirurgias múltiplas, esterilize os instrumentos cirúrgicos entre os usos com o esterilizador de esferas de vidro quente.
   2. Coloque o camundongo doador em decúbito dorsal em uma placa de acrílico fina e limpa envolta em uma cortina estéril sob o microscópio cirúrgico com ampliação de 8-30X.
   3. Depois de garantir a anestesia cirúrgica adequada, conforme descrito na seção 1.1, prossiga com a cirurgia.
   4. Usando uma tesoura estéril, faça uma única incisão abdominal longitudinal inferior da linha média, do púbis ao processo xifóide.
   5. Abra as paredes abdominais para expor a cavidade usando um pequeno afastador.
   6. Usando aplicadores estéreis com ponta de algodão, retraia suavemente os intestinos superiormente à esquerda do animal e cubra com gaze umedecida com solução salina. Mova os órgãos reprodutivos inferiormente e localize a aorta infrarrenal e a veia cava inferior (VCI). Umedeça os tecidos expostos periodicamente com solução salina.
   7. Usando a pinça médica nº 5, separe a aorta da VCI, desde o nível da artéria renal esquerda até a bifurcação. Use suturas de monofilamento de poliamida 10-0 para ligar os pequenos ramos próximos à aorta.
   8. Uma vez que a aorta do doador tenha sido separada da VCI, sature o vaso com solução salina, cubra a cavidade exposta com gaze umedecida e coloque o doador de lado em uma área estéril. Verifique o estado do doador (função respiratória e cardiovascular e profundidade da anestesia) a cada 15 min. Comece a operar no receptor, isolando a aorta conforme descrito abaixo (Etapas 2.2.1 a 2.2.7).
   9. Uma vez que a aorta receptora tenha sido separada da VCI e colocada de lado, retorne o doador ao microscópio. Pinça cruzada (proximal e distal ao segmento de interesse) da aorta doadora, com aproximadamente 5 mm de distância, com duas pinças microvasculares de 4 mm.
   10. Usando a microtesoura Vannas-Tübingen, faça uma transecção de um pequeno segmento de enxerto (3 a 4 mm de comprimento) da aorta abdominal.
   11. Usando uma agulha 25 G 5/8 acoplada a uma seringa, lave a aorta excisada com solução salina heparinizada (100 U/ml). Certifique-se de que a ponta da agulha não entre em contato com o recipiente.
   12. Coloque a aorta em solução salina heparinizada (100 U/ml) sobre gelo e reserve. Ainda sob anestesia profunda, solte os grampos microvasculares. Eutanasiar o doador por exsanguinação.
   13. Implante o vaso doador dentro de 30 minutos após a excisão. Embora seja possível usar um vaso doador para vários receptores excisando um comprimento maior da aorta, mantenha o tempo isquêmico em menos de 30 minutos.
2. Operação do destinatário
   1. Mantenha uma técnica asséptica durante toda a operação, como na operação do doador.
   2. Coloque o camundongo receptor em decúbito dorsal em uma fina placa de acrílico envolta em uma cortina estéril sob o microscópio cirúrgico com ampliação de 8-30X.
   3. Depois de garantir a anestesia adequada, prossiga com a cirurgia quando o animal não apresentar reflexo de retirada.
   4. Usando uma tesoura estéril, faça uma única incisão abdominal longitudinal inferior da linha média, do púbis ao processo xifóide.
   5. Abra as paredes abdominais para expor a cavidade usando um pequeno afastador.
   6. Usando aplicadores estéreis com ponta de algodão, retraia suavemente os intestinos superiormente à esquerda do animal e cubra com gaze umedecida com solução salina. Mova os órgãos reprodutivos inferiormente e localize a aorta infrarrenal e a VCI. Umedeça os tecidos expostos periodicamente com solução salina.
   7. Separe a aorta da VCI, desde o nível da artéria renal esquerda até a bifurcação. Use suturas de monofilamento de poliamida 10-0 para ligar os pequenos ramos próximos à aorta, se necessário.
   8. Pinça cruzada (proximal e distal ao segmento de interesse) da aorta, a aproximadamente 5 mm de distância, com duas pinças microvasculares de 4 mm.
   9. Usando a microtesoura Vannas-Tübingen, faça uma única aortotomia horizontal e ressece um pequeno segmento (não mais que 0,5 mm) da aorta abdominal para acomodar o enxerto aórtico do doador.
   10. Lave a aorta excisada com solução salina heparinizada (100 U/ml). O enxerto aórtico do doador deve ter comprimento adequado para conectar as extremidades aórticas seccionadas do receptor.
   11. Colocar o enxerto aórtico do doador na posição ortotópica e anastomosar a extremidade do enxerto do doador com a extremidade do receptor, combinando a orientação anatômica do respectivo enxerto com a do receptor.
   12. Segure suavemente a túnica externa do vaso e inverta-a levemente usando a pinça médica nº 5. Usando a pinça, conduza a agulha presa à sutura de monofilamento de poliamida 10-0 através de toda a espessura da parede do vaso para prender o enxerto aórtico doador ao vaso ressecado do receptor. Certifique-se de que a abertura do recipiente não esteja fechada devido à costura inadvertida da parede traseira do recipiente.
   13. Para pontos contínuos, coloque suturas de suporte às 9 horas nas extremidades superior e inferior do enxerto. Começando na extremidade superior do enxerto a partir das 3 horas, anastomose as extremidades ressecadas com 2 pontos corridos e prenda a sutura à sutura de suporte.
       1. Vire o enxerto e continue a sutura contínua até a parte dorsal do vaso, encontrando a sutura de origem. Fixe sem aplicar muita pressão no recipiente. Repita a sutura para a anastomose inferior.
          Nota: As suturas interrompidas começam da mesma forma que as suturas contínuas, exceto que o vaso é anastomosado com três pontos separados entre as suturas de permanência. O tempo de anastomose é geralmente de 20 min.
   14. Quando a anastomose estiver concluída, solte o grampo microvascular distal para permitir que o sangue retrógrado flua e verifique se há vazamento dos locais anastomosados. Se houver um vazamento, coloque imediatamente um ponto para fechar o local defeituoso. Se não houver sangramento nos locais, solte o grampo proximal.
   15. Examine o transplante e verifique se não há obstrução sanguínea no enxerto e nas porções proximal e distal do vaso do receptor. Um padrão de pulso vigoroso nos vasos do doador e do receptor indica que o sangue flui livremente. Usando o par de pinças, segure suavemente uma extremidade das suturas de permanência e ligeiramente o vaso para inspecionar a parede posterior do vaso.
       nota: Não deve haver enrugamento da parede do vaso em ambas as extremidades dos locais anastomosados. O fluxo sanguíneo deficiente após a remoção dos grampos é um sinal de trombose.
   16. Retorne os intestinos para a cavidade abdominal usando aplicadores com ponta de algodão.
   17. Com o porta-agulha Castroviejo e a pinça Graefe, feche a parede abdominal com pontos de polipropileno 5-0 com costura contínua. Feche a camada de pele com as mesmas suturas usando o fechamento subcuticular.
   18. Administre Torbugesic (1 mg / kg) i.m. imediatamente após a conclusão do transplante.
   19. Administre imediatamente, na ordem, Atipamezol (1 mg / kg), cetoprofeno (5 mg / kg) e solução de Ringer com lactato aquecida por via subcutânea.
   20. Imediatamente após a cirurgia, coloque os ratos em uma gaiola aquecida sob um cobertor de água durante a noite (12 horas). Durante o período de recuperação anestésica, coloque os animais sozinhos em uma área limpa, seca e desobstruída. Forre a gaiola (autoclavada) com toalhas de papel limpas e ajuste a temperatura da manta de água para aproximadamente 20 a 22 °C. Forneça croquetes secos e úmidos ad libitum no chão da gaiola.
       nota: Um componente essencial dos cuidados pós-cirúrgicos é observar o animal e a intervenção apropriada, conforme necessário, durante a recuperação da anestesia e da cirurgia. A intensidade de monitorização necessária varia de acordo com o animal e pode ser maior durante o período de recuperação imediata do anestésico do que mais tarde na recuperação pós-operatória.
   21. Monitore continuamente os animais que foram submetidos à anestesia até que se recuperem completamente. O animal deve ser capaz de manter a decúbito esternal sem ajuda e deve parecer calmo e sem dor antes de ser deixado sem vigilância.
   22. Dê buprenorfina (0,1 mg / kg BID) e cetoprofeno (5 mg / kg SID) por três dias, ambos por via subcutânea.
   23. Monitore a função cardiovascular e respiratória, a temperatura corporal e a dor ou desconforto pós-operatório durante a recuperação da anestesia por pelo menos três dias. Cuidados adicionais podem ser necessários, como a administração de analgésicos e outros medicamentos e fluidos parenterais para minimizar a desidratação e a perda de eletrólitos.
   24. Avalie o sucesso da cirurgia de transplante observando a função motora dos membros posteriores. O sucesso completo do transplante envolve fluxo sanguíneo desobstruído para o membro posterior e cauda, que deve ser imediato após a recuperação do animal, e recuperação total sem paralisia dos membros posteriores no segundo dia.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6J (H-2B)	Laboratórios Jackson, Bar Harbour ME	Cepa# 000664
Balb/cBYJ	Laboratórios Jackson, Bar Harbour ME	Cepa # 001026
Injeção de cloridrato de cetamina USP 100 mg / mL	Ketalean	00612316 DIN
Injeção de xilazina 20 mg/mL	Rompum	02169592 DIN
Injeção de cetoprofeno 100 mg / mL	Anafen	DIN 01938126
Injeção de tartarato de butorfanol 10 mg / mL	Torbugesic	RUÍDO 008450000
Injeção de buprenorfina 0,3 mg / mL	Reckitt Benckiser	B.N. 5241
Solução injetável estéril de cloridrato de atipamezol	Anti-sedan	02237744 DIN
Injeção de heparina sódica, USP, 1000 unidades / mL	Distribuição McKesson	02264315 DIN
Lágrimas pomada oftálmica naturale	Alcon	02082519 DIN
Estereomicroscópio	Leica	M80
0,9% de cloreto de sódio, estéril	Corporação Baxter
Solução de Ringer com lactato, estéril	Corporação Baxter
Injeção de cloreto de sódio a 0,9%, estéril, 10 mL	Corporação Baxter
Almofadas de preparação de álcool	Loris
Iodopovidona	Betadine
Gluconato de clorohexidina 4% p / v	Germi-Stat
Monofilamento de poliamida preta	Instrumentos AROSurgical	T4A10Q07
Sutura, sutura 10-0, 70 mícrons	corporação
Sutura de monofilamento azul 5-0, agulha P3	Ética	8698G
Seringa de 1 ml	Bd	REF 309659
Seringa de 10 ml	Bd	REF 309604
Seringa de insulina TB de 1cc com 28G 1/2	Bd	REF 309309
25G 7/8, agulha hipodérmica	Bd	REF 305124
27G 1/2, agulha hipodérmica	Bd	REF 305109
Afastador Colibri - 1,5cm de extensão 4cm	Ferramentas de Belas Ciências	17000-04
S&T CAF-4 Clipe de aplicação de fórceps, sem trava	Ferramentas de Belas Ciências	Nº 00072-14
Pinça Supergrip, S&T	Ferramentas de Belas Ciências	00632-11
Pinça médica nº 5	Ferramentas de Belas Ciências	11253-20
Tesoura para bebês Lexer	Ferramentas de Belas Ciências	14078-10
Micro Adson fórceps serrilhado	Ferramentas de Belas Ciências	11018-12
Microtesoura Vannas-Tübingen	Ferramentas de Belas Ciências	15003-08
Micro grampos, b-1; 3,5 mm x 1 mm; comprimento de 7 mm	Ferramentas de Belas Ciências	00396-01
Pinça Graefe, 10cm 1x2 dentes	Ferramentas de Belas Ciências	11054-10
Castroviejo com fechadura e mandíbulas de tungstênio	Ferramentas de Belas Ciências	12565-14
Esterilizador de esferas de vidro quente	Inotech 250	IS-250 - Steri-250
Gazes não tecidas	Progene
Aplicadores com ponta de algodão	puritano
Aparador de barba	Wahl
Almofada de aquecimento	raio de sol