Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Preparação Cirúrgica, Anestesia e Regime de Analgesia
- Coloque um campo descartável estéril (45,7 cm x 66 cm) na plataforma cirúrgica. Pegue suavemente o camundongo, injete cetamina (50 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg) por via intraperitoneal (ip) para anestesia e injete 0,05 mg / kg de buprenorfina por via subcutânea para analgesia.
- Garanta a profundidade da anestesia beliscando os dedos, raspe o cabelo em toda a área do abdômen com uma navalha e coloque o mouse na plataforma cirúrgica estéril sob o microscópio cirúrgico com ampliação de 6 a 10x.
2. Colheita de baço de doador
- Esterilize o abdômen com uma almofada de preparação de álcool, prenda os membros com fita cirúrgica e faça uma incisão vertical na pele da linha média de 3-4 cm do púbis ao processo xifóide com uma tesoura.
- Retraia a parede abdominal com afastadores estéreis feitos de clipes de papel. Mova os intestinos para o flanco direito do abdômen (lado esquerdo do cirurgião) com um cotonete estéril para expor o baço. Cauterize a veia gástrica curta aderida ao baço com um cautério estéril de baixa temperatura (Figura 1A). Coloque um pedaço de gaze estéril embebida em solução salina a 37 ° C sobre o baço para mantê-lo úmido ( Figura 1B ).
- Separe e mobilize a veia porta do tecido pancreático (Figura 1C) ligando os ramos da veia porta (veia pancreaticoduodenal superior e veia gástrica direita); coloque uma sutura ao redor da veia porta distal da veia esplênica (Figura 1D).
- Vire o baço para o lado direito para expor a aorta e o tronco celíaco com a artéria esplênica (Figura 1E). Dissecar e mobilizar a artéria aórtica-celíaca-esplênica ligando a artéria hepática e a artéria gástrica; colocar uma sutura ao redor da aorta proximal à artéria celíaca (Figura 1F-G).
- Injete 100 unidades internacionais (UI) de heparina na veia cava inferior (VCI) para heparinizar todo o corpo e aguarde 3 minutos para garantir que a heparina faça efeito. Ligue a aorta proximal à artéria celíaca, faça o transecto da veia porta e, em seguida, perfunda todo o corpo com 10 mL de solução salina heparinizada fria (4 °C) (10 mL/20 s) da aorta abdominal distal ao tronco celíaco (Figura 1H).
- Colete o enxerto de baço em bloco com o segmento aórtico-celíaco-esplênico associado e a veia porta, juntamente com um segmento de veia esplênica e uma pequena porção de tecido pancreático. Preserve o enxerto em 5 mL de solução salina a 4 °C antes do transplante. Eutanasiar o camundongo por luxação cervical.
3. Esplenectomia do receptor e implante de enxerto de baço
- Coloque uma almofada de aquecimento na plataforma cirúrgica e ajuste a temperatura para 37 °C. Coloque uma cortina estéril (45,7 cm x 66 cm) em cima da almofada de aquecimento para criar uma plataforma cirúrgica estéril. Repita as etapas 2.1 e 2.2 para preparação cirúrgica e anestesia. Faça uma incisão na linha média de 3-4 cm e retraia a parede abdominal conforme descrito na etapa 2.1 e na etapa 2.2.
- Mova cuidadosamente o intestino para o lado direito do camundongo com um cotonete estéril para expor o baço do receptor. Ligue a veia e a artéria esplênicas e remova o baço.
- Mova cuidadosamente o intestino para o lado esquerdo do camundongo e cubra os intestinos com gaze úmida (embebida em solução salina estéril a 37 ° C). Dissecar e ligar os ramos lombares da aorta infrarrenal e VCI; pinçamento cruzado da aorta infrarrenal e da VCI usando dois grampos microvasculares de 4 mm.
- Coloque uma sutura de náilon 11-0 através da aorta infrarrenal (uma espessura total) e retraia para criar uma aortotomia elíptica por um único corte com microtesoura (o comprimento deve corresponder ao diâmetro da aorta doadora, Figura 2A). Perfure a VCI usando uma agulha de 30 G para criar uma venotomia elíptica e estenda a abertura para o comprimento compatível com a veia porta doadora usando uma microtesoura (Figura 2A).
- Limpe o sangue intraluminal ou coágulo sanguíneo (na aorta e VCI) com 500 μL de solução salina heparinizada (10 unidades/mL).
- Coloque o enxerto de baço no flanco direito do abdômen do camundongo receptor; identifique cuidadosamente o manguito aórtico do doador e a veia porta do doador. Depois de se certificar de que os vasos não estão torcidos, cubra o enxerto de baço com gaze embebida em solução salina fria (4 °C).
- Conecte o manguito aórtico do doador ao ápice proximal e distal da aortaotomia do receptor com duas suturas de permanência (sutura de náilon 11-0, igual à abaixo) (Figura 2B, C). Faça uma anastomose com 2-3 mordidas de pontos contínuos de náilon 11-0 entre o manguito aórtico do doador e a aortaotomia do receptor (parede anterior) (Figura 2D). Vire o enxerto de baço para o lado esquerdo do receptor; fazer a anastomose entre o manguito aórtico do doador e a aortotomia do receptor (parede posterior) (Figura 2E).
- Realizar uma anastomose para conectar a veia porta do doador à parede posterior da VCI do receptor, usando 4 a 5 mordidas de suturas contínuas no interior da VCI e, em seguida, fechar a sutura na parte externa da VCI (Figura 2F,G).
- Solte as pinças do vaso e use cotonete estéril para tamponar o sangramento até que a cor do baço seja recuperada (Figura 2H).
- Feche o abdômen com uma sutura de vicryl absorvível sintético 5-0 em um padrão contínuo. Feche a camada de pele com uma sutura de náilon 5-0 em um padrão interrompido.
nota: Para as etapas 3.7-3.8, alternativamente, faça uma anastomose entre a veia porta do doador e a VCI do receptor primeiro (etapa 3.8); Em seguida, faça uma anastomose entre o manguito aórtico do doador e a parede posterior da aortotomia do receptor, usando 2 a 3 suturas contínuas no interior da aorta e feche a sutura na parte externa da aorta.
4. Recuperação Animal
- Injete 1 mL de solução salina morna por via subcutânea através de 4 locais separados (0,25 mL/local) após fechar o abdômen.
- Mantenha o rato numa incubadora com temperatura controlada (30 °C) durante as primeiras horas após a operação, monitorize o rato até que recupere a consciência suficiente e, em seguida, transfira o rato para uma nova gaiola limpa com comida e água normais, com uma almofada de aquecimento (30 °C) por baixo da gaiola. Mantenha o camundongo após a cirurgia em uma gaiola separada.
5. Tratamento da dor pós-cirúrgica
- Injetar 0,05 mg/kg de buprenorfina por via subcutânea 24 h e 48 h após a cirurgia para manter o regime de analgesia.
