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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Preparação de estoques quantificados de glicerol de Bacillus Calmette-Guerin (BCG) dinamarquês e Mycobacterium tuberculosis H37Rv
NOTA: Todos os protocolos descritos foram realizados em condições de nível de biossegurança 3 (BSL3).
- Descongelar os estoques de glicerol congelado das cepas BCG dinamarquesas ou H37Rv e inocular 100 μl em 10 ml de meio 7H9 suplementado com Tween-80 0,05% (v/v) e ADC (Albumina, Dextrose, Catalase) 10% (v/v).
- Incubar em condições estáticas durante uma semana a 37 °C até que a cultura esteja em fase logarítmica.
- Aumente a cultura bacteriana transferindo a cultura de 10 ml para 200 ml de meio fresco. Incubar por mais 20 dias em condições estáticas.
- Transferir para tubos de centrifugação de 50 ml e centrifugar durante 15 min a 2500 x g.
- Rejeitar os sobrenadantes e ressuspender o sedimento bacteriano no volume residual. Adicione esferas de vidro estéreis de 3 mm de diâmetro a cada tubo (10 - 15 por tubo).
- Vortex vigorosamente por 1 min para dissociar aglomerados bacterianos. Ressuspenda cada pellet em 10 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) com Tween-80 0,05% (v / v).
- Deixe os tubos por 10 min, permitindo que os maiores agregados bacterianos e contas de vidro se assentem.
- Recuperar 9,5 ml de sobrenadante de cada um dos 4 tubos contendo pequenos aglomerados e bactérias isoladas e transferir os volumes para um único tubo de centrifugação fresco de 50 ml (volume final recuperado de 38 ml). Centrifugue por 10 min a 400 x g.
- Recuperar 35 ml de sobrenadante (contendo principalmente bactérias isoladas) num único tubo de centrifugação fresco de 50 ml e adicionar 15 ml de PBS com glicerol a 50% (v/v), obtendo uma concentração final de glicerol de 15% (v/v).
- Misturar delicadamente e distribuir em alíquotas de 1 ml em tubos apropriados para congelação. Armazenar a -80 °C (um lote fornece aproximadamente 50 alíquotas de estoque de glicerol).
- Para quantificar os estoques de glicerol, descongele o glicerol no dia seguinte ao congelamento e execute sete diluições seriadas de dez vezes em tubos separados de 1,5 ml contendo 900 μl de PBS.
- Placa 100 μl de cada diluição em meio de ágar sólido 7H10 suplementado com ADC 10% (v/v) preparado em placas de Petri de 55 mm de diâmetro.
- Adicione cuidadosamente esferas de vidro de 3 mm de diâmetro (aprox. 10 por placa) e agite suavemente a placa para distribuir igualmente o volume sobre a placa de ágar. Descarte as contas e sele a placa de ágar com parafilme.
- Incubar durante 21 dias a 37 °C e determinar a concentração bacteriana contando as unidades formadoras de colónias (UFC) nas diluições em que as colónias individuais podem ser distinguidas com precisão.
2. Vacinação de camundongos
- Descongelar um glicerol BCG pré-quantificado e diluí-lo em PBS para preparar duas suspensões. Calcular o volume final considerando que a dose por animal é de 100 μl para administração subcutânea (107 UFC por ml para vacinação subcutânea) e 40 μl para administração intranasal (2,5 x 107 UFC para vacinação intranasal).
- Use uma estação de trabalho de anestesia especializada para roedores para anestesiar camundongos com uma mistura de isoflurano e oxigênio. Use isoflurano 5% para induzir a anestesia e 2% para manter os camundongos na câmara de anestesia. (Outro método de anestesia aceito pode ser usado).
- Para a administração subcutânea da vacina, encher uma seringa de 1 ml com uma agulha de 26 G com 1 ml de suspensão bacteriana (107 UFC/ml). Remova as bolhas de ar.
- Coloque um camundongo anestesiado em uma superfície plana em decúbito ventral dentro de uma capela de fluxo laminar e inocule por via subcutânea 100 μl (106 UFC / dose) de vacina em um flanco do dorso do camundongo. Retorne o mouse à gaiola e monitore-o para garantir que ele se recupere adequadamente da anestesia.
- Troque a agulha da seringa entre cada administração no camundongo. Bolhas de ar removidas conforme descrito acima.
- Para administração intranasal, coloque um camundongo anestesiado em decúbito dorsal dentro do capô.
- Com uma micropipeta, tomar 20 μl da suspensão com 2,5 x 107 UFC/ml. Colocar o inóculo gota a gota entre as duas narinas até que todo o volume tenha sido depositado, deixando tempo entre as gotas para permitir que o camundongo respire o volume em.
NOTA: os ratos podem sofrer de desconforto respiratório durante este procedimento, portanto, devem ser deixados para assimilar cada gota antes de administrar a próxima para evitá-la o máximo possível.
- Encha novamente a micropipeta com mais 20 μl e repita a operação. Se o camundongo começar a acordar da anestesia após a primeira inoculação, coloque-o na câmara de anestesia antes da segunda. Retorne o mouse para a gaiola e certifique-se de que ele se recupere adequadamente da anestesia.
3. Desafio intranasal de camundongo com cepa H37Rv
- Descongelar um glicerol H37Rv pré-quantificado e diluí-lo em PBS para preparar uma suspensão bacteriana de 2.500 UFC por ml. Calcular o volume final considerando que a dose por animal é de 40 μl.
- O H37Rv é inoculado por via intranasal, conforme descrito em 2.5 - 2.7. A dose final de provocação por camundongo é de 102 UFC/40 μl.