Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Preparação do material
NOTA: A cirurgia é realizada em condições assépticas. Antes de começar, certifique-se de que todos os instrumentos cirúrgicos, incluindo as brocas, sejam limpos com um desinfetante apropriado.
- Prepare uma mistura anestésica: 0,02 mg/mL de fentanil, 0,4 mg/mL de midazolam e 0,2 mg/mL de medetomidina (concentrações finais na mistura).
NOTA: Consulte a respectiva seção de discussão para anestésicos alternativos.
- Prepare uma mistura de antídotos: 0,07 mg/ml de flumazenil e 0,42 mg/ml de atipamezol (concentrações finais na mistura).
- Monte o cateter e a tampa do cateter com a entrada e o parafuso. Corte o cateter em um comprimento de 2 mm com um bisturi (Figura 1).
NOTA: Não use tesouras para isso, pois elas apertam e distorcem a forma da seção transversal circular da ponta do cateter.
2. Preparação Cirúrgica
- Anestesiar o rato por uma administração intraperitoneal da mistura anestésica (1,5 mL / kg de peso corporal).
- Raspe a cabeça do rato entre as orelhas usando o barbeador elétrico. Coloque um cobertor homeotérmico na estrutura estereotáxica antes de posicionar o animal, para evitar hipotermia durante toda a cirurgia.
- Imobilize a cabeça do rato na estrutura estereotáxica usando as barras auriculares e a placa de mordida, garantindo que a cabeça esteja horizontal e estável. Verifique a estabilidade aplicando pressão no crânio com o dedo ou fórceps.
NOTA: Uma fixação frouxa e um posicionamento não horizontal dentro do quadro estereotáxico podem causar um desvio das coordenadas pretendidas.
- Aplique colírios lubrificantes para evitar o ressecamento da córnea durante a cirurgia. Cubra os olhos com um material opaco para evitar qualquer exposição cirúrgica à luz.
- Limpe a área raspada alternando a aplicação de etanol 70% e complexo iodopovidona 10%.
NOTA: Siga todas as medidas de precaução durante a cirurgia para evitar infecções. A cirurgia é realizada em condições assépticas. Se a assepsia for quebrada, o material contaminado deve ser substituído.
3. Implante de cateter
- Faça uma incisão longitudinal de cerca de 2 cm de comprimento no meio da pele da cabeça. Use grampos de buldogue para segurar a pele nas laterais. Para obter uma visão geral dessas etapas, consulte a Figura 2.
- Remova o sangue usando um aplicador com ponta de algodão.
- Remova o periósteo do crânio. Limpe o tecido com o aplicador de ponta de algodão e exponha o osso do crânio. Deixe o crânio secar por cerca de 1 min.
- Identifique os pontos de referência anatômicos, Lambda, Bregma e sutura medial. Com a broca instalada na estrutura estereotáxica, posicione a ponta da broca no Bregma como ponto de partida. Mova 2 mm posterior do Bregma e mova ~ 2,4 mm lateralmente para a sutura medial.
- Faça um orifício de 0,5 mm de diâmetro para o cateter nesta posição. Limpe suavemente qualquer pó de osso.
NOTA: É importante que a dura-máter permaneça intacta durante a perfuração. Para garantir isso, 1) use uma broca que possa ser instalada na estrutura estereotáxica, 2) inspecione o furo com frequência durante a perfuração e 3) perfure em pequenos passos. Se muita pressão for aplicada ao crânio, a ponta da broca continuará e danificará o cérebro quando o crânio for totalmente penetrado.
- Faça mais 3 furos (~1,3 mm de diâmetro) para os parafusos de ancoragem a alguns milímetros de distância do primeiro furo. Sopre suavemente o pó de osso.
NOTA: Selecione locais de parafusos de ancoragem que forneçam espaço suficiente para a parte superior do cateter (~2 mm de diâmetro) e as tampas dos parafusos de ancoragem (~1 mm).
- Remova o pó ósseo por irrigação com cerca de 1 a 2 mL de solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS) ou solução salina fisiológica usando uma seringa. Limpe o crânio. Aperte os parafusos de ancoragem em 2 - 3 voltas completas.
NOTA: Os parafusos de ancoragem são necessários para estabilizar a configuração, mantendo o cimento dentário e, assim, o cateter no lugar. Ao apertar um parafuso de ancoragem, certifique-se de que ele não seja facilmente removível, levantando-o suavemente para cima com uma pinça. Como a implantação do cateter em si causa trauma tecidual, a dura-máter adicional durante a perfuração ou aperto dos parafusos de ancoragem levará a múltiplas lesões traumáticas e possivelmente dificultará a comparabilidade dentro de um grupo. Aperte os parafusos de ancoragem primeiro e insira o cateter por último.
- Insira o cateter de 2 mm de comprimento através do primeiro orifício, perpendicular à superfície do crânio. Ainda segurando o cateter, aplique um pouco de cimento dental e deixe polimerizar com uma breve exposição (~5 s) à luz de polimerização para estabilizar o cateter, permitindo o uso de ambas as mãos na próxima etapa.
cuidado: Ao trabalhar com uma luz de fotopolimerização dentária, evite olhar diretamente para a ponta ou para a luz refletida da área de aplicação, pois a alta intensidade dessa luz pode causar danos à retina. Use óculos de proteção apropriados.
- Aplique mais cimento dentário ao redor do cateter, ancore os parafusos e solidifique o cimento dental com a luz de polimerização dentária (~15 - 30 s). Confirme o endurecimento do cimento com a ponta de uma pinça.
4. Fechamento da ferida e antagonização da anestesia
- Fechar a pele da cabeça com pontos reabsorvíveis, anterior e posterior ao cateter.
NOTA: Como haverá uma configuração irregular sobre o crânio no final do implante, feche a ferida de acordo. Levantar demais a pele resultará em desconforto para o animal.
- Injete a mistura de antídoto por via subcutânea (1,5 mL / kg de peso corporal) usando uma seringa de 1 mL com uma agulha de 26 G.
- Administre enrofloxacina (2,5%) por injeção subcutânea (7,5 mg / kg de peso corporal) para tratamento profilático com antibióticos. Administre carprofeno (1 mg / mL; 5 mg / kg de peso corporal) e buprenorfina (1,2 mg / kg) para alívio da dor por injeção subcutânea.
5. Cuidados pós-operatórios e medicação
- Retorne o animal à gaiola modificada e mantenha-o sob observação por 1 a 3 h, com aplicação de luz infravermelha para evitar hipotermia. Observe e reposicione constantemente o animal a cada 5 a 10 minutos até a recuperação pós-operatória. Tome especial cuidado para evitar a exposição constante à luz dos olhos até a recuperação.
- Repita as administrações de enrofloxacina (7,5 mg / kg de peso corporal) e carprofeno (1 mg / mL; 5 mg / kg de peso corporal) por injeções subcutâneas no dia seguinte à cirurgia. A buprenorfina não precisa ser atualizada, pois o tratamento anterior é eficaz por 72 horas.
6. Preparação da mistura de imunização (no mínimo 14 dias após o implante do cateter)
NOTA: Coloque as seringas no gelo durante o procedimento de preparação.
- Conecte duas seringas de vidro Luer lock de 10 mL aos braços curtos de uma torneira de 3 vias e feche a terceira saída com o braço longo.
- Certifique-se de que as conexões estejam seguras e sem vazamentos: adicione aproximadamente 4 mL de PBS estéril à seringa aberta enquanto segura o pistão 2. Insira o pistão 1 e empurre os dois pistões para frente e para trás enquanto verifica se há vazamentos. Se não ocorrer vazamento, descarte o PBS e remova o pistão 1 novamente.
- Pipetar 1 mL de adjuvante de Freund incompleto (IFA) e 50 μg de glicoproteína de oligodendrócitos de mielina recombinante (rMOG1-125) juntos e ajustar a mistura para um volume final de 2 mL com PBS estéril (pH 7,4) em um tubo adequado.
NOTA: Devido às perdas de emulsão nas pontas ou paredes das seringas durante a preparação, prepare um volume maior do que o pretendido para a administração. Da mesma forma, é mais prático preparar mais de 1 animal de uma só vez.
- Coloque a mistura diluída de IFA e rMOG1-125 na seringa aberta. Insira o pistão com cuidado, mantendo uma pressão solta no pistão oposto (Figura 3A).
- Emulsione o inóculo conduzindo-o de uma seringa para a outra, empurrando os pistões para frente e para trás até que fique branco e viscoso (Figura 3B).
- Fixe uma seringa Luer lock de 1 mL no braço curto aberto da torneira de 3 vias e encha-a com inóculo (Figura 3C). Distribua todo o inóculo para seringas de 1 mL. Mantenha-o no gelo até a injeção. Administre a mistura no dia da preparação.
7. Imunização
- Anestesiar o rato com isoflurano em uma câmara (~ 2 min, misturado com oxigênio 2 L / min) e, em seguida, manter a anestesia através de uma máscara (misturado com oxigênio 1,5 L / min).
- Injetar 200 μL de inóculo por via subcutânea na base da cauda usando uma agulha 21 G.
NOTA: Administre a injeção lentamente, pois a solução é viscosa.
8. Injeção intracerebral de citocinas
- Ajuste o comprimento da cânula do conector (2 mm). (Consulte a Figura 4 para obter as etapas de preparação.)
- Encha uma seringa de 1 mL com a mistura de citocinas (500 ng/μL de fator de necrose tumoral-alfa (TNF-alfa), 300 U/μL de interferon-gama de rato recombinante (IFN-gama) em PBS estéril). Conecte a seringa a uma cânula conectora. Encha a cânula com a mistura de citocinas. Evite bolhas.
- Monte a seringa na bomba de seringa programável e programe-a para injetar 0,2 μL/min (Figura 5A). Ligue a bomba e mantenha-a funcionando para evitar a formação de bolhas de ar na ponta da cânula.
NOTA: A velocidade de injeção deve levar em consideração o diâmetro interno da seringa específica utilizada; Assim, o diâmetro da seringa deve ser registrado durante a configuração da bomba.
- Anestesiar o rato com isoflurano em câmara (~2 min, misturado com 2 L/min de oxigênio) e, em seguida, manter a anestesia através de máscara (misturada com 1,5 L/min de oxigênio) (Figuras 5B e 5C). Aplicar colírio lubrificante pois o animal ficará anestesiado por pelo menos 30 min.
- Remova a tampa do cateter com a entrada. Insira a cânula do conector no cateter e aperte-a e aperte-a (Figuras 5D e 5E).
NOTA: Não aperte demais, pois isso destruirá a ponta superior do cateter.
- Deixar a injeção prosseguir durante 10 minutos (o volume total de injeção é de 2 μL). Pare a bomba. Deixe a cânula dentro do cateter por 20 minutos para permitir que o volume injetado se difunda completamente.
- Desaparafuse a cânula do conector e remova-a lentamente para evitar um efeito de vácuo.
- Recoloque a tampa do cateter com a entrada e aperte-a. Permita que o animal se recupere da anestesia em uma gaiola.
