Gerando a desmielinização cortical cerebral generalizada em um modelo de rato

Resumo

Fonte: Üçal, M. et al., Modelo de rato de desmielinização cortical cerebral generalizada induzida por uma injeção intracerebral de citocinas pró-inflamatórias. J. Vis. Exp. (2021)

O vídeo demonstra um método para gerar um modelo de rato com desmielinização cortical cerebral generalizada. Isso envolve a interrupção da barreira hematoencefálica injetando citocinas pró-inflamatórias em camundongos preparados com proteína recombinante da bainha de mielina. Esse processo facilita a infiltração de células imunológicas, resultando em desmielinização cortical cerebral generalizada.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Preparação do material

NOTA: A cirurgia é realizada em condições assépticas. Antes de começar, certifique-se de que todos os instrumentos cirúrgicos, incluindo as brocas, sejam limpos com um desinfetante apropriado.

1. Prepare uma mistura anestésica: 0,02 mg/mL de fentanil, 0,4 mg/mL de midazolam e 0,2 mg/mL de medetomidina (concentrações finais na mistura).
   NOTA: Consulte a respectiva seção de discussão para anestésicos alternativos.
2. Prepare uma mistura de antídotos: 0,07 mg/ml de flumazenil e 0,42 mg/ml de atipamezol (concentrações finais na mistura).
3. Monte o cateter e a tampa do cateter com a entrada e o parafuso. Corte o cateter em um comprimento de 2 mm com um bisturi (Figura 1).
   NOTA: Não use tesouras para isso, pois elas apertam e distorcem a forma da seção transversal circular da ponta do cateter.

2. Preparação Cirúrgica

1. Anestesiar o rato por uma administração intraperitoneal da mistura anestésica (1,5 mL / kg de peso corporal).
2. Raspe a cabeça do rato entre as orelhas usando o barbeador elétrico. Coloque um cobertor homeotérmico na estrutura estereotáxica antes de posicionar o animal, para evitar hipotermia durante toda a cirurgia.
3. Imobilize a cabeça do rato na estrutura estereotáxica usando as barras auriculares e a placa de mordida, garantindo que a cabeça esteja horizontal e estável. Verifique a estabilidade aplicando pressão no crânio com o dedo ou fórceps.
   NOTA: Uma fixação frouxa e um posicionamento não horizontal dentro do quadro estereotáxico podem causar um desvio das coordenadas pretendidas.
4. Aplique colírios lubrificantes para evitar o ressecamento da córnea durante a cirurgia. Cubra os olhos com um material opaco para evitar qualquer exposição cirúrgica à luz.
5. Limpe a área raspada alternando a aplicação de etanol 70% e complexo iodopovidona 10%.
   NOTA: Siga todas as medidas de precaução durante a cirurgia para evitar infecções. A cirurgia é realizada em condições assépticas. Se a assepsia for quebrada, o material contaminado deve ser substituído.

3. Implante de cateter

1. Faça uma incisão longitudinal de cerca de 2 cm de comprimento no meio da pele da cabeça. Use grampos de buldogue para segurar a pele nas laterais. Para obter uma visão geral dessas etapas, consulte a Figura 2.
2. Remova o sangue usando um aplicador com ponta de algodão.
3. Remova o periósteo do crânio. Limpe o tecido com o aplicador de ponta de algodão e exponha o osso do crânio. Deixe o crânio secar por cerca de 1 min.
4. Identifique os pontos de referência anatômicos, Lambda, Bregma e sutura medial. Com a broca instalada na estrutura estereotáxica, posicione a ponta da broca no Bregma como ponto de partida. Mova 2 mm posterior do Bregma e mova ~ 2,4 mm lateralmente para a sutura medial.
5. Faça um orifício de 0,5 mm de diâmetro para o cateter nesta posição. Limpe suavemente qualquer pó de osso.
   NOTA: É importante que a dura-máter permaneça intacta durante a perfuração. Para garantir isso, 1) use uma broca que possa ser instalada na estrutura estereotáxica, 2) inspecione o furo com frequência durante a perfuração e 3) perfure em pequenos passos. Se muita pressão for aplicada ao crânio, a ponta da broca continuará e danificará o cérebro quando o crânio for totalmente penetrado.
6. Faça mais 3 furos (~1,3 mm de diâmetro) para os parafusos de ancoragem a alguns milímetros de distância do primeiro furo. Sopre suavemente o pó de osso.
   NOTA: Selecione locais de parafusos de ancoragem que forneçam espaço suficiente para a parte superior do cateter (~2 mm de diâmetro) e as tampas dos parafusos de ancoragem (~1 mm).
7. Remova o pó ósseo por irrigação com cerca de 1 a 2 mL de solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS) ou solução salina fisiológica usando uma seringa. Limpe o crânio. Aperte os parafusos de ancoragem em 2 - 3 voltas completas.
   NOTA: Os parafusos de ancoragem são necessários para estabilizar a configuração, mantendo o cimento dentário e, assim, o cateter no lugar. Ao apertar um parafuso de ancoragem, certifique-se de que ele não seja facilmente removível, levantando-o suavemente para cima com uma pinça. Como a implantação do cateter em si causa trauma tecidual, a dura-máter adicional durante a perfuração ou aperto dos parafusos de ancoragem levará a múltiplas lesões traumáticas e possivelmente dificultará a comparabilidade dentro de um grupo. Aperte os parafusos de ancoragem primeiro e insira o cateter por último.
8. Insira o cateter de 2 mm de comprimento através do primeiro orifício, perpendicular à superfície do crânio. Ainda segurando o cateter, aplique um pouco de cimento dental e deixe polimerizar com uma breve exposição (~5 s) à luz de polimerização para estabilizar o cateter, permitindo o uso de ambas as mãos na próxima etapa.
   cuidado: Ao trabalhar com uma luz de fotopolimerização dentária, evite olhar diretamente para a ponta ou para a luz refletida da área de aplicação, pois a alta intensidade dessa luz pode causar danos à retina. Use óculos de proteção apropriados.
9. Aplique mais cimento dentário ao redor do cateter, ancore os parafusos e solidifique o cimento dental com a luz de polimerização dentária (~15 - 30 s). Confirme o endurecimento do cimento com a ponta de uma pinça.

4. Fechamento da ferida e antagonização da anestesia

1. Fechar a pele da cabeça com pontos reabsorvíveis, anterior e posterior ao cateter.
   NOTA: Como haverá uma configuração irregular sobre o crânio no final do implante, feche a ferida de acordo. Levantar demais a pele resultará em desconforto para o animal.
2. Injete a mistura de antídoto por via subcutânea (1,5 mL / kg de peso corporal) usando uma seringa de 1 mL com uma agulha de 26 G.
3. Administre enrofloxacina (2,5%) por injeção subcutânea (7,5 mg / kg de peso corporal) para tratamento profilático com antibióticos. Administre carprofeno (1 mg / mL; 5 mg / kg de peso corporal) e buprenorfina (1,2 mg / kg) para alívio da dor por injeção subcutânea.

5. Cuidados pós-operatórios e medicação

1. Retorne o animal à gaiola modificada e mantenha-o sob observação por 1 a 3 h, com aplicação de luz infravermelha para evitar hipotermia. Observe e reposicione constantemente o animal a cada 5 a 10 minutos até a recuperação pós-operatória. Tome especial cuidado para evitar a exposição constante à luz dos olhos até a recuperação.
2. Repita as administrações de enrofloxacina (7,5 mg / kg de peso corporal) e carprofeno (1 mg / mL; 5 mg / kg de peso corporal) por injeções subcutâneas no dia seguinte à cirurgia. A buprenorfina não precisa ser atualizada, pois o tratamento anterior é eficaz por 72 horas.

6. Preparação da mistura de imunização (no mínimo 14 dias após o implante do cateter)

NOTA: Coloque as seringas no gelo durante o procedimento de preparação.

1. Conecte duas seringas de vidro Luer lock de 10 mL aos braços curtos de uma torneira de 3 vias e feche a terceira saída com o braço longo.
2. Certifique-se de que as conexões estejam seguras e sem vazamentos: adicione aproximadamente 4 mL de PBS estéril à seringa aberta enquanto segura o pistão 2. Insira o pistão 1 e empurre os dois pistões para frente e para trás enquanto verifica se há vazamentos. Se não ocorrer vazamento, descarte o PBS e remova o pistão 1 novamente.
3. Pipetar 1 mL de adjuvante de Freund incompleto (IFA) e 50 μg de glicoproteína de oligodendrócitos de mielina recombinante (rMOG_1-125) juntos e ajustar a mistura para um volume final de 2 mL com PBS estéril (pH 7,4) em um tubo adequado.
   NOTA: Devido às perdas de emulsão nas pontas ou paredes das seringas durante a preparação, prepare um volume maior do que o pretendido para a administração. Da mesma forma, é mais prático preparar mais de 1 animal de uma só vez.
4. Coloque a mistura diluída de IFA e rMOG_1-125 na seringa aberta. Insira o pistão com cuidado, mantendo uma pressão solta no pistão oposto (Figura 3A).
5. Emulsione o inóculo conduzindo-o de uma seringa para a outra, empurrando os pistões para frente e para trás até que fique branco e viscoso (Figura 3B).
6. Fixe uma seringa Luer lock de 1 mL no braço curto aberto da torneira de 3 vias e encha-a com inóculo (Figura 3C). Distribua todo o inóculo para seringas de 1 mL. Mantenha-o no gelo até a injeção. Administre a mistura no dia da preparação.

7. Imunização

1. Anestesiar o rato com isoflurano em uma câmara (~ 2 min, misturado com oxigênio 2 L / min) e, em seguida, manter a anestesia através de uma máscara (misturado com oxigênio 1,5 L / min).
2. Injetar 200 μL de inóculo por via subcutânea na base da cauda usando uma agulha 21 G.
   NOTA: Administre a injeção lentamente, pois a solução é viscosa.

8. Injeção intracerebral de citocinas

1. Ajuste o comprimento da cânula do conector (2 mm). (Consulte a Figura 4 para obter as etapas de preparação.)
2. Encha uma seringa de 1 mL com a mistura de citocinas (500 ng/μL de fator de necrose tumoral-alfa (TNF-alfa), 300 U/μL de interferon-gama de rato recombinante (IFN-gama) em PBS estéril). Conecte a seringa a uma cânula conectora. Encha a cânula com a mistura de citocinas. Evite bolhas.
3. Monte a seringa na bomba de seringa programável e programe-a para injetar 0,2 μL/min (Figura 5A). Ligue a bomba e mantenha-a funcionando para evitar a formação de bolhas de ar na ponta da cânula.
   NOTA: A velocidade de injeção deve levar em consideração o diâmetro interno da seringa específica utilizada; Assim, o diâmetro da seringa deve ser registrado durante a configuração da bomba.
4. Anestesiar o rato com isoflurano em câmara (~2 min, misturado com 2 L/min de oxigênio) e, em seguida, manter a anestesia através de máscara (misturada com 1,5 L/min de oxigênio) (Figuras 5B e 5C). Aplicar colírio lubrificante pois o animal ficará anestesiado por pelo menos 30 min.
5. Remova a tampa do cateter com a entrada. Insira a cânula do conector no cateter e aperte-a e aperte-a (Figuras 5D e 5E).
   NOTA: Não aperte demais, pois isso destruirá a ponta superior do cateter.
6. Deixar a injeção prosseguir durante 10 minutos (o volume total de injeção é de 2 μL). Pare a bomba. Deixe a cânula dentro do cateter por 20 minutos para permitir que o volume injetado se difunda completamente.
7. Desaparafuse a cânula do conector e remova-a lentamente para evitar um efeito de vácuo.
8. Recoloque a tampa do cateter com a entrada e aperte-a. Permita que o animal se recupere da anestesia em uma gaiola.

Resultados

Figura 1: Preparo do cateter. (A e B) A cânula guia e a cânula fictícia (tampa do cateter com entrada) são montadas e aparafusadas. (C) Em seguida, o cateter é cortado em 2 mm de tamanho com a ajuda de um bisturi. A observação microscópica mostrou que o uso de tesouras para esse fim distorce a forma circular da ponta da cânula e, portanto, deve ser e...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Ratos Agouti Escuro machos adultos (300 ±25 g)
Fentanil	Hameln pharma plus, Alemanha		Como citrato de fentanil, 50 μg/ml
Midazolam	ERWO Pharma, Áustria	50039017	5 mg/ml
Medetomidina	Orion Pharma, Finlândia		Como cloridrato de medetomidina, 1mg/ml
Flumazenil	Roche, Suíça		0,1 mg/ml
Atipamezol	Orion Pharma, Finlândia		Como cloridrato de atipamezol, 5 mg/ml
10% de complexo de iodopovidona	Mundipharma, Áustria
Cimento dentário	Heraeus Kulzer, Alemanha	Nº 6603 7633
Solução salina fisiológica	Fresenius Kabi, Áustria		0,9% NaCl
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)	Sigma-Aldrich, Alemanha	Pág. 3813
Isofluorano	AbbVie, Áustria
Colírio lubrificante	Thea Pharma, Áustria
70% EtOH	Merck, Alemanha	1070172511	O etanol absoluto foi diluído em ddH2O para preparação de 70% v/v
2,5% de enrofloxacina	Bayer, Alemanha		Antibióticos profiláticos
Carprofeno	Pfizer, EUA		Analgésicos, 50 mg/ml
Interpolação-20	Sigma-Aldrich, Alemanha	Pág. 9416
Pentobarbital	Richter Pharma, Áustria		Pentobarbital sódico, 400 mg/ml
Interferon gama	PeproTech, EUA	400-20
Fator de necrose tumoral alfa	Sistemas de P&D, EUA	510-RT-050/CF
rMOG1-125	produto próprio no Centro de Medicina Molecular, Instituto Karolinska, Suécia		Glicoproteína recombinante de oligodendrócitos de mielina de rato, aminoácidos 1-125 do terminal N, também disponível comercialmente: AnaSpec, AS-55152-500, EUA
Adjuvante de Freund incompleto	Sigma-Aldrich, Alemanha	F5506
Albumina de soro bovino	Sigma-Aldrich, Alemanha	Rolamento A9576
Solução de substrato de peroxidase	Vector Laboratories, EUA	SK-45000
Quadro estereotáxico	David Kopf Instruments, EUA
Cateteres adequados para ressonância magnética	PlasticsOne, EUA	8IC315GPKXXC
Cânulas fictícias	PlasticsOne, EUA	8IC315DCNSPC
Parafusos de plástico, adequado para ressonância magnética	PlasticsOne, EUA	8L080X093N01
Cânula do conector	PlasticsOne, EUA	8IC313CXSPCC
Chave de fenda com tamanho de ponta de 2 mm
Furadeira com extensão de eixo flexível	Proxxon, Alemanha	N.° 28 472, N.° 28 706, N.° 28 620,
Broca, redonda, 0,5 mm	Hager & Meisinger, Alemanha	REF310 104 001 001 009
Broca, torcida, 1,3 mm	Hager & Meisinger, Alemanha	REF350 104 417 364 013
bisturi	Braun, Alemanha	BB510
Cabo de bisturi	Fine Science Tools, Alemanha	91003-12
Aplicador de ponta de algodão	Henry Schein Medical, Áustria	900-3155
Tesoura cirúrgica	Fine Science Tools, Alemanha	14101-14, 14088-10
Pinça cirúrgica	Fine Science Tools, Alemanha	11002-12, 11251-35
Grampos de buldogue	Fine Science Tools, Alemanha	18050-35
Manta homeotérmica	Sistemas TSE, Alemanha
Lâmpada infravermelha	Beurer, Alemanha	616,51
Luz de polimerização dentária	Guilin Woodpecker Medical, China
Sutura absorvível	Johnson & Johnson, Bélgica	V792E
Bomba de seringa programável	World Precision Instruments, EUA	AL-1000
Luvas de exame
Bata cirúrgica
Barbeador elétrico	Aesculap, Alemanha	GT420
Vaporizador anestésico volátil	Rothacher Medical, Suíça	CV 30-301-D
Fonte de oxigênio para vaporizador anestésico volátil	Air Liquide, Áustria	19.113
Câmara de anestesia volátil	Rothacher Medical, Suíça	PS-0347
Máscara de anestesia para ratos	Rothacher Medical, Suíça	PS-0307-A
Seringa de 1 ml	Codan, Dinamarca	REFERÊNCIA 62.1612
Agulha de calibre 26 para injeção	Braun, Alemanha	4657683
Agulha de calibre 20 para injeção de citocinas e imunização	Braun, Alemanha	4657519
Seringas de vidro com ponta Luer lock	Poulten & Graf, Alemanha	7.140-37
torneira de 3 vias	Becton Dickinson, Suécia	Rolamento 394600
Incubadora 37°C	Kendro, Alemanha	50042301
Micropipetas	Gilson, Estados Unidos	F167350