Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Esterilização
- Desinfete as pinças antes da coleta das cabeças, pegando uma pinça limpa e realizando a esterilização por calor seco em um forno a 200 °C por 1 h. Autoclave todos os artigos de vidro a 121 °C por 15 min antes de usar.
- Realize todos os trabalhos descritos em um gabinete de microbiologia classe 2. Prepare todos os reagentes de acordo com as instruções do fabricante.
2. Coleta de amostra
- No matadouro, os cordeiros Swaledale eram abatidos por atordoamento usando eletricidade ou uma pistola de parafuso cativo e exsanguinados. Recolher as cabeças de borrego no máximo 4 h após o abate.
3. Preparação das cabeças
- Desinfete a parte da testa do cordeiro despejando aproximadamente 100 mL de solução de dióxido de cloro a 200 ppm na área da amostra. Raspe a parte da testa da cabeça usando uma tesoura elétrica e lave a área com 200 mL de solução de dióxido de cloro a 200 ppm.
- Limpe a área com etanol e rolo azul e cubra a área da amostra com creme depilatório por 35 min. Raspe suavemente o creme depilatório usando uma ferramenta de raspagem e avalie a área da amostra. Se restar uma quantidade significativa de pelos, repita o processo de depilação.
- Use mais 200 mL de solução de dióxido de cloro para enxaguar a área e, em seguida, enxágue com etanol e limpe com um rolo azul.
- Usando um punção de biópsia estéril de 8 mm, corte amostras de pele de 8 mm da área preparada. Remova as amostras usando uma pinça estéril e um bisturi de 15 lâminas, garantindo que toda a gordura cutânea seja removida.
- Coloque as amostras em um frasco estéril de 0,5 L cheio de solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS) e, em seguida, transfira-as para tubos estéreis de 50 mL com 50 mL de solução de dióxido de cloro a 200 ppm, inverta duas vezes e deixe esterilizar por 30 min.
- Remova as amostras da solução de dióxido de cloro e lave-as colocando-as em um tubo de 50 mL cheio de 40 mL de PBS estéril. Depois de lavado, coloque cada amostra de pele individual em um poço separado de uma placa de 24 poços.
- Adicione 350 μL de meio pré-aquecido, mantendo a amostra na interface ar-líquido. A composição do meio é a seguinte: meio MK (meio 199 com sais de Hanks, L-glutamato e 1,75 mg/mL de bicarbonato de sódio) e F12 de Ham na proporção de 1:1, com adição de soro fetal bovino (FBS, 10% v/v), fator de crescimento epidérmico (EGF, 10 ng/mL), insulina (5 μg/mL), penicilina-estreptomicina (100 U/mL), e anfotericina B (2,5 μg/mL).
- Sele as placas de 24 poços com uma vedação de placa permeável a gás e incube a 37 °C em uma incubadora de tecido umidificado a 5% de CO2 por até 24 h.
4. Manutenção das amostras cutâneas
- Após a incubação, remova o meio de cultura e lave as amostras em 500 μL de solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS). Adicione meios sem antibióticos a cada amostra e incube a 37 °C em uma incubadora de tecido umidificado de CO5 2 por 24 h para remover antibióticos residuais na amostra.
- Se a turbidez ou infecção fúngica se desenvolver no meio livre de antibióticos após 24 horas, descarte a amostra.
5. Preparação do inóculo
- Prepare um tubo de 50 mL com 10 mL de caldo de soja tríptico estéril. Pegue um prato de ágar fresco de S. aureus e use um cotonete para transferir várias colônias para o caldo. Incubar durante 18 h a 37 °C a 150 rpm.
- Centrifugue a 4.000 x g por 3 min. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 10 mL de PBS estéril. Repita duas vezes para garantir a lavagem adequada das células.
- Ajustar o inóculo a 0,6 OD600 em PBS estéril. Confirme a carga de inóculo realizando uma contagem manual de placas viáveis.
6. Infecção de amostras de pele
- Prepare uma nova placa de 24 poços com 400 μL de meio pré-aquecido sem antibióticos e adicione as inserções de 24 poços usando uma pinça estéril.
- Remova o meio das amostras de pele, lave com 500 μL de PBS estéril e remova a lavagem. Use uma pinça estéril para segurar suavemente a amostra no fundo do poço.
- Use uma biópsia por punção de 4 mm para fazer um retalho central da ferida, perfurando até uma profundidade aproximada de 1-2 mm. Em seguida, use um bisturi de 15 lâminas e uma pinça de tecido allis dentada estéril para remover a camada superior do retalho da ferida. A variabilidade nas dimensões da ferida pode afetar o resultado da infecção e as unidades formadoras de colônias (UFC).
- Depois que todas as amostras forem feridas, transfira-as para os insertos de 24 poços usando uma pinça estéril. Pipetar 15 μL do inóculo bacteriano no leito da ferida. Em seguida, incubar por 24 h a 37 °C em uma incubadora de tecido umidificado com 5% de CO2.
- Se forem necessários períodos de incubação mais longos, remova o meio e substitua-o por meio novo a cada 24 h e incube nas mesmas condições.
