Uma técnica para edição de genes em células assassinas naturais usando CRISPR Cas9

Resumo

Fonte: Naeimi Kararoudi, M., et al. Geração de células NK humanas primárias e expandidas knock-out usando ribonucleoproteínas Cas9. J. Vis. (2018).

Este vídeo demonstra uma técnica para modificação genética mediada por ribonucleoproteína Cas9 de células assassinas naturais primárias (NK). Uma ribonucleoproteína Cas9, consistindo de uma endonuclease Cas9 ligada a um RNA guia (gRNA) formado pelo emparelhamento de bases de um RNA CRISPR (crRNA) e um crRNA transativador (tracrRNA), é introduzido em células assassinas naturais primárias por meio de eletroporação. A ribonucleoproteína tem como alvo e cliva o DNA do hospedeiro no local alvo, levando ao nocaute do gene por meio da modificação do gene alvo por meio da maquinaria de reparo celular.

Protocolo

Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.

1. Purificação e Expansão de Células NK Humanas

1. Isole as células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) de Buffy Coat.
   1. Camada de 35 mL de amostra de buffy coat em 15 mL de Ficoll-Paque.
   2. Centrifugue a 400 x g por 20 minutos sem freio e colete o PBMC da interface.
   3. Lave os PBMCs recuperados três vezes adicionando pelo menos um volume igual de PBS, centrifugando a 400 x g por 5 minutos e aspirando a lavagem do PBC. A célula NK pode ser isolada nesta fase por RosettesSep.
2. Expanda as células NK estimulando com células alimentadoras irradiadas de 10 x 10⁶ mbIL21 nos dias 0, 7 e 14. Substitua a mídia por RPMI novo contendo 10% de FBS, 1% de glutamina, 1% de penicilina estreptomicina e 100 UI/mL de IL-2 para todo o volume de mídia em dias alternados.

2. Desenho e Seleção de gRNA

1. Escolha os loci genômicos específicos a serem direcionados, usando ferramentas online, por exemplo, NCBI, Ensemble.
   exemplo.
   Descrição: Fator de crescimento transformador beta receptor 2 (TGFBRR2) ectodomínio
   Ver registro: PF08917
   Veja o InterPro: IPR015013
   Posição: 49 - 157 aa
   Sequência direcionada: Éxon 4 do gene TGFBR2 (ENSG00000163513)
2. Para projetar os gRNAs, use ferramentas da web de design CRISPR, como http://crispr.mit.edu e 'Benchling'.
   1. Insira a sequência de DNA escolhida na etapa 2.1. Escolha humano (hg 19) como genoma alvo. Guias CRISPR (20 nucleotídeos seguidos por uma sequência de motivo adjacente ao protoespaçador (PAM): NGG) serão escaneados a partir da sequência inserida anteriormente. Ele também mostra possíveis correspondências fora do alvo em todo o genoma selecionado.
   2. Escolha os três melhores gRNAs que têm a pontuação mais alta, com base em suas taxas no alvo e fora do alvo. Por exemplo, a Tabela 1 mostra os RNAs CRISPR projetados para atingir o éxon 4 do gene TGFBR2 sugerido pelas ferramentas da web de design CRISPR.
3. Ordene os RNAs CRISPR como crRNAs sintéticos específicos de sequência.
4. Ordene que um RNA transativador conservado (tracrRNA) interaja por homologia parcial com o crRNA.

3. Primers de triagem de exclusão de design

1. Projete primers abrangendo os locais de clivagem do gRNA para o ensaio de mutação T7E1.
2. Use primers a pelo menos 100 pb de distância do local de clivagem previsto para garantir que pequenas inserções-deleções (indels) no local alvo do sgRNA apareçam no gel de agarose a 1,5% após o ensaio de mutação. A Tabela 2 mostra os primers que são usados para amplificar o ectodomínio TGFBR2.

4. Transdução de células NK primárias humanas e expandidas

Nota: A transdução de elementos Cas9/RNPs em NK é feita por eletroporação usando o sistema 4D da seguinte forma.

1. Preparação de células
   1. Para células NK primárias, incubar células NK recém-isoladas em meio do Roswell Park Memorial Institute (RPMI) na presença de 100 UI/mL de IL-2 por 4 dias e realizar a eletroporação no Dia 5. Substitua a mídia a cada dois dias, conforme descrito anteriormente e no dia anterior à transdução.
   2. Para células NK expandidas, estimule as células no dia 0 com células alimentadoras irradiadas na proporção de 1:1 e realize a eletroporação no dia 5, 6 ou 7. Substitua a mídia a cada dois dias, conforme descrito anteriormente e no dia anterior à transdução.
   3. No dia da eletroporação, preparar um frasco T25 preenchido com 8 mL de RPMI fresco contendo 100 UI/mL de IL-2 para células submetidas à eletroporação e frascos pré-incubados em uma incubadora umidificada de 37 °C e 5% de CO₂.
      nota: Células descongeladas ou células que sofreram 2ª ou 3ª estimulação podem ser eletroporadas a qualquer momento após sua recuperação, conforme descrito.
   4. Tome 3 - 4 × 10⁶ células por condição para 26 μL de mistura de transdução.
      nota: A concentração muito alta de células NK na solução de eletroporação aumenta a taxa de transdução.
   5. Lave as células 3 vezes com PBS para remover todo o FBS, que geralmente contém atividade de RNase. Gire-os para baixo a cada vez a 300 x g por 8 minutos.
      nota: Considere 7 condições de eletroporação para Cas/RNPs como gRNA único (gRNA1, gRNA2, gRNA3) e uma combinação de dois gRNAs (gRNA1+gRNA2, gRNA1+gRNA3, gRNA2+gRNA3) e um controle sem Cas9/RNPs.
2. Forma o crRNA:tracerRNA/complexo
   1. Ressuspenda crRNAs (gRNA1, gRNA2 e gRNA3) e tracerRNA em solução 1x TE até concentrações finais de 200 μM. Misture 2,2 μL de cada gRNA de 200 μM com 200 μM de tracerRNA conforme mostrado na Tabela 3.
   2. Aquecer as amostras a 95 °C durante 5 min e deixar arrefecer em bancada até à temperatura ambiente (15 - 25 °C). Armazenar RNAs ressuspensos e crRNA: tracrRNA/complexo a -20 °C para uso posterior.
3. Formam o complexo RNP
   Nota: Para economizar tempo, forme o complexo RNP durante a etapa de lavagem 4.1.5.
   1. Para uma única reação duplex crRNA:tracrRNA, diluir a endonuclease Cas9 a 36 μM, conforme mostrado no exemplo da Tabela 4.
   2. Para transdução combinada de duplexes crRNA:tracrRNA, dilua a endonuclease Cas9 a 36 μM, conforme mostrado no exemplo na Tabela 5.
   3. Adicione a endonuclease Cas9 aos duplexes crRNA:tracrRNA lentamente enquanto gira a ponta da pipeta, por mais de 30 s a 1 minuto.
   4. Incube a mistura em temperatura ambiente por 15 a 20 min. Se não estiver pronto para usar a mistura após a incubação, mantenha a mistura no gelo até o uso.
4. Eletroporação
   1. Adicione todo o suplemento à solução de eletroporação P3 e mantenha-o à temperatura ambiente.
   2. Ressuspenda o pellet celular (3 - 4 × 10⁶ células da etapa 4.1.5) em 20 μL de solução de eletroporação 4D primária P3. Evite bolhas de ar durante a pipetagem.
      Nota: As células não devem ser deixadas por muito tempo na solução P3.
   3. Adicione imediatamente 5 μL de complexo RNP (Etapa 4.3) à suspensão celular.
   4. Adicione 1 μL de intensificador de eletroporação Cas9 100 μM à mistura Cas9/RNPs/célula.
   5. Transfira Cas9 / RNPs / mistura de células para tiras de eletroporação de 20 μL.
   6. Bata suavemente nas tiras para certificar-se de que a amostra cubra a parte inferior das tiras.
   7. Inicie o sistema de eletroporação 4D e escolha o programa EN-138.

Tabela 1. Três gRNAs projetados para direcionar o éxon 4 do ectodomínio TGFBR2 como crRNA sintético.

gRNA NÃO.	Sequência de gRNA	Ordenado como crRNA sintético
gRNA1	5 CCCCTACCATGACTTTATTC 3	/AltR1/rArGrUrCrArGrGrUrArGrArGrGrCrUrCrUrArGrCrUrUrCrUrUrCrU/AltR2/
gRNA2	5 ATTGCACTCATCAGAGCTAC 3	/AltR1/rArUrUrCrArCrUrCrArCrArUrCrArGrArCrUrCrUrArGrCrUrArCrUrUrCrUrUrCrU/AltR2/
gRNA3	5 AGTCATGGTAGGGGAGCTTG 3	/AltR1/rArG rUrCrA rUrGrG rUrGrGrG rArGrC rUrUrG rGrUrA rGrArG rCrUrA rUrGrCrU/AltR2/

Tabela 2. Primers usados para amplificar o gene do ectodomínio TGFBR2

TGFBR 2 ectodomínio Primers FWD	5 GTC TGC TCC AGG TGA TGT TTA T3
TGFBR2 ectodomínio Primer REV	5 GGG CCT GAG AAT CTG CAT TTA 3

Tabela 3. Forme o crRNA:tracrRNA/complexo usando RNAs de 200 μM

componente	Quantidade (uL)
200 μM crRNA	2.2
RNA traçador de 200 μM	2.2
Buffer IDTE	5.6
Produto final	10

Tabela 4. Para uma única reação duplex crRNA:tracrRNA, diluir a endonuclease Cas9 a 36 μM.

componente	Quantidade (μL)
Pbs	1
crRNA:tracrRNA duplex (da etapa 4.2)	2 (200 pmol)
Endonuclease Alt-R Cas9 (estoque de 61 μM)	algarismo
Volume total	5 ul

Tabela 5. Para transdução combinada de crRNA: os duplexes tracrRNA diluem a endonuclease Cas9 a 36 μM.

componente	Quantidade (μL)
Pbs	1
crRNA:tracrRNA duplex (ex. gRNA1)	1 (100 pmol)
crRNA:tracrRNA duplex (ex. gRNA2)	1 (100 pmol)
Alt-R Cas9 endonuclease	algarismo
Volume total	5 μL

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
RosetteSep™ Coquetel de enriquecimento de células NK humanas	Tecnologias STEMCELL	15065	O Coquetel de Enriquecimento de Células NK Humanas RosetteSep™ foi projetado para isolar células NK do sangue total por seleção negativa.
Ficoll-Paque® PLUS	GE Healthcare - Ciências da Vida	17-1440-02
Alt-R® CRISPR-Cas9 tracrRNA	Tecnologias integradas de DNA	1072532	TracrRNA que contém modificações químicas proprietárias que conferem maior resistência à nuclease. Hibridiza em crRNA para ativar a enzima Cas9
Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA	Tecnologias integradas de DNA		Produzido sinteticamente como Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA, com base na sequência de gRNA projetado visando o gene do interesse
Kit de detecção de edição de genoma Alt-R®	Tecnologias integradas de DNA	1075931	Cada kit contém endonuclease T7EI, tampão de reação T7EI e controles de ensaio T7EI.
Platina® Taq DNA Polimerase Alta Fidelidade	Invitrogen	11304-011
Sistema 4D-Nucleofector™	Lonza	AAF-1002B
Proteína IL-2 recombinante humana	Novartis	Nº 65483-0116-07
Kit 4D-Nucleofector™ X de Célula Primária P3	Lonza	V4XP-3032	Contém vetor pmaxGFP™, solução de nucleofector™, suplemento, tiras de nucleocuvette™ de 16 poços
Não direcionado: siRNA personalizado, padrão 0,05 2mol ON-TARGETplus	Dharmacon	CTM-360019
Alt-R® S.p. Cas9 Nuclease 3NLS	Tecnologias integradas de DNA	1074181	Cas9 Nuclease
Manual de Sangue e Tecido DNeasy®	Qiagen	Nº 69504
RNeasy Mini Kit	Qiagen	Rolamento 74104
Calceína AM	ThermoFisher	C3099
TGFβ	Biolenda	580706
Kit de controle Alt-R® CRISPR-Cas9, humano	Tecnologias integradas de DNA	1072554	Inclui tracrRNA, crRNA de controle positivo HPRT, crRNA #1 de controle negativo, HPRT Primer Mix e tampão duplex livre de nuclease.
IDTE pH 7,5 (1X Solução TE)	Tecnologias integradas de DNA	01-11-02-02
Alt-R® Cas9 Aprimorador de Eletroporação	Tecnologias integradas de DNA	1075915	Intensificador de eletroporação Cas9