Geração de vírus influenza vivos atenuados recombinantes para vacinas

Neste artigo

Resumo

Fonte: Pérez-Girón, J. V. et al, Administração intranasal de vacinas recombinantes contra influenza em modelos quiméricos de camundongos para estudar a imunidade da mucosa.J. Vis. Exp. (2015)

O vídeo mostra um método para criar vírus influenza recombinantes adaptados ao frio. Envolve a transfecção de células humanas com plasmídeos bidirecionais, seguida de incubação em incubação de temperatura mais baixa para produzir vírus adequados para a produção de vacinas, caracterizada por replicação reduzida em condições mais quentes.

Protocolo

1. Geração de Vacinas Vivas Atenuadas Recombinantes contra a Gripe por Genética Reversa

NOTA: O protocolo detalhado para a geração de vírus influenza recombinantes por genética reversa foi descrito por estudos anteriores e está fora do escopo deste relatório. Resumidamente, o resgate de vacinas contra influenza adaptadas ao frio (CAV) é feito em um gabinete de classe II de biossegurança sob contenção de nível de biossegurança 2 (BSL2) e envolve as etapas detalhadas abaixo.

Gerar uma vacina contra influenza adaptada ao frio usando como pano de fundo a cepa A / Ann Arbor / 6/60 (H2N2) adaptada ao frio, bem como a hemaglutinina (HA) e uma neuraminidase modificada (NA) da cepa A / PR / 8/34 (H1N1) (Figura 1A). A modificação no gene NA consiste em uma substituição baseada em PCR de uma sequência conservada no pedúnculo da proteína (resíduos 65 a 72) por uma sequência curta de cDNA que codifica o peptídeo derivado da ovalbumina de galinha (OVA) SIINFEKL (Figura 1B). O peptídeo SIINFEKL é um peptídeo altamente imunodominante no contexto da resposta restrita H-2b MHC classe I de camundongos C57BL / 6.
Placa 10⁶ células 293T por poço em placas de 6 poços usando DMEM 10% de soro fetal bovino (FBS) suplementado com 1% de penicilina/estreptomicina (P/E).
Preparar a mistura de transfecção de plasmídeos: Adicionar 1 μg de cada um dos plasmídeos que codificam cDNAs para PB2, PB1, PA, NP, M, NS da cepa influenza A/Ann Arbor/6/60 e 1 μg dos plasmídeos que codificam para NA-SIINFEKL e HA da influenza A/PR/8/34. Adicione o meio essencial mínimo Opti-pré-aquecido (Opti-MEM) (15 μl para um volume final de 100 μl/poço).
Incubar a mistura de transfecção por 30 min em RT.
Adicione 100 μl de mistura de transfecção / poço e incube por 16 horas a 37 ° C e 5% de CO₂.
Troque o meio celular por DMEM 0,3% BSA 1% P / L a 33 ° C e 5% CO₂por 5 horas.
Adicionar 10⁶ células permissivas de Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) em dimetilsulfóxido (DMSO) contendo 1 μg/ml de tripsina do pâncreas bovino tratado com L-1-Tosilamida-2-feniletil clorometilcetona (TPCK-tripsina). Manter as coculturas 293T-MDCK durante 2 a 3 dias a 33 °C e 5% de CO₂.
Colete sobrenadantes de co-culturas de células MDCK-293T e limpe por centrifugação a 260 x g por 5 min.

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Resultados

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Figura 1. Engenharia de LAIVs rastreáveis.(A) Segmentos de influenza clonados em plasmídeos ambisense foram transfectados em células 293T usando Lipofectamine 2000. 24 horas após a transfecção, sobrenadantes obtidos de células 293T foram usados para revestir células renastais permissivas ao rim canino de Madin-Darby (MDCK) na presença de 1% de tripsina TPCK. Todo o protocolo foi real...