Um modelo tridimensional de co-cultura de células T infiltrantes em esferoides tumorais

Resumo

Fonte: Lin, Y., et al. Monitoramento da invasão de células cancerígenas e citotoxicidade de células T em cultura 3D. J. Vis. Exp. (2020).

Este vídeo demonstra um método para estabelecer uma co-cultura tridimensional de esferóides tumorais e células T. Um molde de agarose com micropoços contendo esferóides tumorais é preparado, seguido pela adição de células T. Após a incubação, essa configuração permite estudar a interação das células T com os esferoides tumorais em um ambiente tridimensional controlado.

Protocolo

1. Geração de esferóides

1. Prepare e autoclave agarose a 2% em 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS) (por exemplo, 1 g de agarose em 50 mL de 1x PBS) e autoclave moldes de borracha de 35 e 81 micropoços.
   cuidado: Evite usar agarose de baixo ponto de fusão para gerar os cilindros de agarose para processamento de imuno-histoquímica (IHC).
2. Prepare moldes de agarose
   NOTA: Moldes de 35 micropoços são usados para ensaios de invasão, imunofluorescência (IF) e isolamento celular. Os moldes de 81 micropoços são usados para ensaios de citotoxicidade, IHC, isolamento celular e extração de ácido ribonucleico (RNA).
   1. Depois que a agarose for autoclavada, deixe a agarose derretida esfriar até cerca de 60 a 70 °C. Em uma capela de cultura de células, use a técnica asséptica e pipete 500 μL de agarose derretida em um molde de borracha de 81 micropoços por poço ou 330 μL em um molde de borracha de 35 micropoços por poço.
      cuidado: Evite criar bolhas ao misturar ou pipetar agarose. Remova quaisquer bolhas pipetando suavemente.
   2. Depois que a agarose estiver solidificada, flexione cuidadosamente o molde de borracha para remover o molde de agarose. Por meio deste, coloque as mãos acima da placa do poço apropriada e deixe o molde de agarose cair direto em um poço da placa do poço.
      nota: Flexione o molde de borracha em diferentes posições para evitar flexão excessiva. Pode ser útil flexionar o molde de borracha e empurrar suavemente a partir do fundo ao mesmo tempo.
   3. Para equilibrar os cilindros de agarose, adicione meio de cultura celular, consistindo de Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (2,5 mL / poço para placa de 12 poços e 1 mL / poço para placa de 24 poços). Coloque a placa de poço em uma incubadora de cultura de células (37 °C, 5% CO₂) e incube por 1 h.
3. Enquanto isso, prepare a cultura de células para a semeadura.
   nota: O número total de semeadura celular por elenco de agarose deve ser decidido pelo investigador. Para linhagens celulares de câncer de pâncreas primário murino, 35.000 células/35 micropoços fundidos e 81.000 células/81 micropoços fundidos (em média 1000 células/esferoides) são semeados para todos os ensaios a seguir. O diâmetro médio de um esferóide é de cerca de 150\u2012200 μm após 48 h.
4. Remova o meio de cultura de células ao redor do molde de agarose com uma pipeta P1000 primeiro inclinando a placa do poço. Em seguida, remova cuidadosamente o meio na câmara de semeadura.
5. Semeie cuidadosamente a suspensão de células tumorais preparadas gota a gota na câmara de semeadura celular. Coloque cuidadosamente a placa de volta na incubadora de cultura de células (37 °C, 5% CO₂) por 15 min.
   nota: Durante esta etapa, as células se estabelecerão nos micropoços do elenco de agarose.
6. Adicione meio adicional à parte externa do molde de agarose (2,5 mL / poço para placa de 12 poços e 1 mL / poço para placa de 24 poços).
7. Colocar a placa de poço de volta na incubadora de cultura de células (37 °C, 5% CO₂) durante 48 h.
   nota: Normalmente, leva algumas horas para as células formarem esferóides nos micropoços. Em geral, os esferóides de células tumorais sólidas são formados após 24 h e são estáveis após 48 h. No entanto, isso pode variar entre diferentes linhagens celulares. Se necessário, mudar o meio de cultura de células inclinando cuidadosamente a placa de poço com os cilindros de agarose e removendo o meio de cultura de células circundante com uma pipeta P1000. Em seguida, adicione cuidadosamente o meio fresco, pipetando-o ao longo da parede do poço. Normalmente não é necessário trocar a mídia dentro dos moldes devido ao seu pequeno volume e ao risco de remoção dos esferóides.

2. Co-cultura com células T

1. Ressuspenda o número necessário de células T em 75 μL (gesso de 35 micropoços) ou em 190 μL (gesso de 81 micropoços) do meio de cultura de células T apropriado (RPMI suplementado com 10% de soro fetal bovino e 100 unidades/mL de penicilina/estreptomicina).
2. Remova o meio de cultura celular ao redor do molde de agarose com uma pipeta P1000 primeiro inclinando a placa do poço. Em seguida, remova lenta e cuidadosamente o meio dentro do molde, visando suavemente um canto da câmara de semeadura com uma pipeta P200, mantendo a placa do poço inclinada com a outra mão.
3. (Etapa crítica 1) Como existe o risco de remoção de esferoides, controle a perda de esferoides comparando o número de esferoides dentro dos micropoços antes e depois da remoção do meio, visualizando ao microscópio com ampliação de 10x.
4. Semeie cuidadosamente a suspensão de células T gota a gota na câmara de semeadura do molde de agarose, segurando a pipeta P200 cerca de 0,5 cm acima do gesso.
5. (Etapa crítica 2) Existe o risco de eliminar os esferóides ao adicionar as células T. Portanto, é fundamental adicionar as células T muito lentamente e cerca de 0,5 cm acima da câmara de semeadura.
   nota: Uma possibilidade de diminuir o número de esferoides eliminados é apontar a pipeta para um canto da câmara de semeadura enquanto adiciona as células T, arriscando apenas que os esferoides neste canto sejam eliminados.
6. Coloque cuidadosamente a placa de poço de volta na incubadora de cultura de células (37 °C, 5% CO₂) por 15 min.
7. Retire a placa do poço da incubadora e adicione meio de cultura de células frescas (meio do Roswell Park Memorial Institute (RPMI) suplementado com 10% de soro bovino fetal e 100 unidades / mL de penicilina / estreptomicina) ao redor do molde de agarose, pipetando-o lentamente ao longo da parede do poço.
8. Colocar a placa de volta na incubadora de cultura de células durante 48 h.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placas de Petri 3D	Microtecidos Inc	Z764019 & Z764051	referidos como "moldes de borracha" nos protocolos; moldes de 81 micropoços e 35 micropoços
Corrediças de câmara de 8 poços	Lab-Tek	154534
Agarose Tipo I, baixo EEO	Sigma-Aldrich	Rolamento A6013
DMEM, soro fetal bovino	ThermoFisher	11965092, 16000044	referido como "meio de cultura celular" nos protocolos
RPMI	ThermoFisher	11875093	para meio de cultura de células T