Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Procedimento para Acufecção
NOTA: A quantidade ideal de DNA e a área da superfície da pele alvo podem variar para diferentes genes e precisam ser otimizadas ainda mais. A força de picada e o número de vezes para soltar a camada córnea da pele também podem variar dependendo da espessura da pele. Essas condições devem ser cuidadosamente determinadas após a avaliação do nível de expressão de transcritos de genes acufecados por qRT-PCR.
- Pesar os camundongos e administrar tribromoetanol (400 μg por g de peso corporal) por injeção peritoneal.
NOTA: O 2,2,2-tribromoetanol é um agente anestésico injetável comumente usado em camundongos. As soluções são feitas dissolvendo um 2,2,2-tribromoetanol de grau não farmacêutico (2,5 g) em água destilada (200 mL) contendo 2,5% de 2-metil-2-butanol.
- Use pomada oftalmológica veterinária nos olhos para evitar ressecamento sob anestesia.
nota: O efeito anestésico será induzido em 1 - 2 min. Verifique o reflexo de pinça do dedo do pé para garantir profundidade suficiente da anestesia antes da operação.
- Raspe a pele do flanco dorsal e aplique creme depilatório para dissolver as proteínas da queratina na haste do cabelo.
nota: O uso de creme depilatório para remover os pelos facilitará a infusão de DNA na pele.
- Use bolas de algodão embebidas em água para limpar o creme depilatório.
nota: O creme depilatório é solúvel em água. A remoção completa do creme evitará uma superfície oleosa e garantirá um melhor resultado de picada.
- Use um cotonete estéril embebido em etanol 70% para desinfetar a superfície da pele.
- Marque a área alvo (1 cm x 1 cm) na pele depilada com um estêncil pré-medido. nota: Marcar o local de destino ajudará a aplicar o feixe de agulhas para cima e para baixo dentro de uma área definida. Isso é importante para garantir a entrega da mesma quantidade de DNA a uma área de superfície específica para minimizar a variação de experimento para experimento.
- Coloque uma gota de 10 μL de DNA de plasmídeo (10 μg) na pele marcada.
nota: A quantidade de DNA para acufecção varia de acordo com os diferentes genes e o tipo de vetor de expressão. A quantidade de DNA usada deve ser cuidadosamente titulada antes de realizar o experimento de interesse. O 10 μL é uma pequena gota líquida e fica bem na pele raspada e depilada sem rolar durante a picada. Inclua um grupo de controle de camundongos tratados com 10 μL de DNA vetorial vazio para comparar com camundongos acufecados com o gene do estudo.
- Segure o feixe de agulhas de acupuntura (Figura 1B) e pique a superfície marcada com um movimento para cima e para baixo por 100 vezes ou até que a umidade do DNA no PBS na pele desapareça. nota: Pode ocorrer alguma vermelhidão da superfície da pele. Evite fazer cortes profundos que sangrem.
O número de movimentos de picada para cima e para baixo na superfície da pele é determinado de forma operacional quando a umidade do DNA no PBS (10 μL) desaparece na pele. Decidimos 100 vezes em 30 segundos porque deu os resultados mais consistentes de genes entregues por acufecção. Se aplicável, as agulhas podem ser reutilizadas para até 6 picadas na pele alvo (1 cm x 1 cm cada). Enxágue as agulhas em etanol a 70% e PBS entre a acufecção. Mude para novas agulhas quando estiverem cegas ou para DNA de plasmídeo diferente para evitar contaminação cruzada.
- Coloque os ratos acufected em uma almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal até acordar.
- Devolva os ratos à gaiola quando eles recuperarem a consciência suficiente. nota: Mantenha os camundongos acufecados em gaiolas separadas (menos de 5 animais por gaiola) da gaiola de camundongos não acufecados.
- Coloque a garrafa de água no lugar e devolva a gaiola ao rack IVC (gaiola ventilada individualmente).
2. Cuidados pós-operatórios
- Nas primeiras 48 horas após o procedimento, monitore de perto os camundongos quanto a qualquer desconforto, incluindo alterações comportamentais (inquietação, agitação ou distúrbio alimentar) ou aparência anormal (pelagem áspera ou postura curvada).
