Um ensaio in vitro para avaliar a atividade antitumoral de células T CAR específicas para tumores

Neste artigo

Resumo

Fonte: Kueberuwa, G., et al. Um modelo de linfoma de células B de camundongo singênico para avaliação pré-clínica de células T CAR CD19. J. Vis. Exp. (2018).

Este vídeo demonstra um ensaio in vitro para validar a atividade das células T do receptor de antígeno quimérico (CAR). As células do linfoma de células B que expressam o antígeno CD19 e a luciferase citoplasmática são co-cultivadas com células T CAR específicas para CD19. A ligação do CAR ao CD19 em um tumor induz as células T CAR a liberar citocinas e toxinas que causam citotoxicidade das células tumorais. A atividade das células T CAR é avaliada pela quantificação da citocina liberada e diminuição da bioluminescência mediada pela luciferase nas células tumorais.

Protocolo

1. Validação in vitro da atividade das células T CAR

Semeie células tumorais CD19+ alvo singênico com ou sem expressão de luciferase a uma densidade de 1 x 10⁴ células em meio de células T completas (TCM) de 100 μL/poço em uma placa de cultura de tecidos de fundo em U de 96 poços.
Adicione 1 x 10⁴ células T CAR CD19/poço em um volume de 100 μL/poço para obter uma proporção efetor para alvo (E:T) de 1:1.
nota: As relações E:T devem ser estabelecidas para cada construção CAR e linhagem celular alvo.
Use células T isoladas e células tumorais isoladas como controles negativos e células T estimuladas por forbol-miristato-acetato (PMA) (50 ng/mL) e ionomicina (1 μg/mL) como controle positivo para liberação de interferon-gama (IFNγ). Co-cultura de células a 37 °C, 5% de CO₂ por 16-24 h.
Após a co-cultura, centrifugar as placas a 500 x g por 5 min e coletar o sobrenadante para posterior análise de IFNγ e IL-12p70 ELISA.
nota: Isso pode ser armazenado a -80 °C.
Ressuspenda os grânulos celulares em 100 μL de PBS contendo luciferina (concentração final de 1,5 mg / mL). Incubar as placas durante 10 min a 37 °C. Em seguida, meça a luminescência de cada poço com um luminômetro adequado.
nota: Os tempos de exposição devem ser otimizados para linhagens celulares e densidade. Os resultados representativos são mostrados na Figura 1a. A citotoxicidade ex-vivo de células T CAR pode ser modificada para expressar luciferina por co-cultura com linhagens celulares que expressam o antígeno alvo. À medida que as células T CAR matam as células-alvo, a luciferina é liberada, portanto, uma redução no sinal de luminometria está correlacionada com a morte celular. As células não transduzidas podem muitas vezes afetar a viabilidade da célula-alvo, principalmente durante longos períodos de incubação. Medir a concentração de IFNγ murino e IL-12p70 no sobrenadante de acordo com os protocolos ELISA do fabricante. Os resultados representativos são mostrados nas Figuras 1b e 1c. A ativação ex-vivo de células T CAR por co-cultura com linhagens celulares que expressam o antígeno alvo pode ser testada analisando o conteúdo do sobrenadante usando ELISA. A proporção de células T CAR para células-alvo e duração do período de co-cultura devem ser otimizadas para cada construção CAR, linhagem-alvo e analito. O tratamento com PMA e ionomicina pode ser usado como um controle positivo para confirmar a qualidade das células T e sua capacidade de resposta.

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Resultados

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Figura 1. Validação da atividade das células T CAR. As células T CAR αmCD19 foram co-cultivadas com células de linfoma A20 modificadas para expressar luciferase (1 x 10⁴:1 x 10⁴) por 16 h em uma placa de 96 poços com fundo em U. Após a co-cultura, as células foram peletizadas e o sobrenadante foi coletado. A) As células foram ressuspensas em PBS e a luminometria...