Um ensaio in vitro para avaliar a citotoxicidade de células assassinas naturais contra células cancerígenas

Resumo

Fonte: Baik, C. H., et al. Um ensaio de citotoxicidade baseado em placas para a avaliação da função citolítica de células assassinas naturais da placenta de ratos. J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo demonstra a realização de um ensaio de liberação de lactato desidrogenase para determinar a citotoxicidade das células natural killer (NK) contra as células cancerígenas alvo. O ensaio quantifica a liberação da enzima lactato desidrogenase citoplasmática das células cancerígenas, medindo a absorbância do produto de cor vermelha formado.

Protocolo

1. Ensaio de citotoxicidade: Protocolo de ensaio

1. Use uma placa de 96 poços com fundo redondo tratada com cultura para configurar a placa conforme sugerido na Tabela 1. Esta tabela mostra os controles experimentais e 3 conjuntos de colunas experimentais NK. Isso pode ser expandido para um total de 10 colunas experimentais NK em uma placa de 96 poços.
2. Centrifugue a placa de ensaio a 250 x g durante 4 min para ter a certeza de que o efetor e as células-alvo estão em contacto. Incube a placa de 96 poços por 5 horas em uma incubadora de câmara umidificada a 37 °C, 5% de CO₂ para obter amplo contato entre as células-alvo e efetoras e a lise da célula-alvo por células efetoras.
   nota: O protocolo pode ser pausado aqui.
3. 45 min antes da colheita dos sobrenadantes, adicione 10 μL de solução de lise 10x aos poços de liberação máxima de LDH da célula-alvo (poços 1E, 1F, 1G e 1H) e coloque a placa de volta na câmara umidificada.
4. Após o tempo de incubação ser concluído, centrifugue a placa a 250 x g por 4 min. Usando um pipetador multicanal, transfira alíquotas de 50 μL de todos os poços para uma nova placa de ensaio de fundo plano de 96 poços.
   nota: Não toque no fundo dos poços para que as células não sejam transferidas para a placa de ensaio fresca. Não use uma placa tratada com cultura como placa de ensaio fresca.

2. Faça o reagente do ensaio.

1. Depois que o tampão de ensaio atingir a temperatura ambiente, adicione 12 mL de tampão de ensaio a um frasco de mistura de substrato. Inverter e agitar suavemente até dissolver completamente. 1 garrafa é suficiente para duas placas de 96 poços.
   nota: O tampão de ensaio deve ser protegido da luz durante o descongelamento. Misture imediatamente antes de usar.
2. Adicione 50 μL de reagente de ensaio a todos os poços na placa de ensaio da etapa 4.6. Cubra a placa com papel alumínio para protegê-la da luz e incube por 30 min em temperatura ambiente.
   nota: O reagente de ensaio recém-fabricado deve ser armazenado em um freezer. O reagente é bom por aproximadamente 8 semanas.
3. Adicione 50 μL de solução de parada a cada poço. Leia a placa dentro de 1 hora após a adição da solução Stop e registre a absorbância a 490 nm.
   Os dados representativos são apresentados na Tabela 2.

Tabela 1: Layout da placa de ensaio. TCS = Liberação espontânea de LDH da célula-alvo (50 μL de células-alvo + 50 μL de meio de célula-alvo); TCM = Liberação Máxima de LDH da Célula-Alvo (50 μL de células-alvo + 50μL de meio de célula-alvo); VCC = Controle de Correção de Volume (50 μL de meio de célula-alvo + 50 μL de meio de célula NK); CMB = Controle de fundo do meio de cultura (50 μL de meio de célula-alvo + 50 μL de meio de célula NK); ECSR = Liberação Espontânea de Células Efetoras (50 μL de células NK + 50 μL de meio de células NK); EW = Alvéolos experimentais (50 μL de células-alvo + 50 μL de células NK).

1	algarismo	3	4	5
Tcs	VCC	ECSR-1	ECSR-2	ECSR-3
Tcs	VCC	ECSR-1	ECSR-2	ECSR-3
Tcs	VCC	ECSR-1	ECSR-2	ECSR-3
Tcs	VCC	ECSR-1	ECSR-2	ECSR-3
Tcm	CMB	EW-1	EW-2	EW-3
Tcm	CMB	EW-1	EW-2	EW-3
Tcm	CMB	EW-1	EW-2	EW-3
Tcm	CMB	EW-1	EW-2	EW-3

Tabela 2: Dados brutos de absorbância de uma placa de ensaio contendo os controles experimentais nas colunas 1 e 2 e poços experimentais para medir a citotoxicidade de células NK placentárias de ratos NP e RUPP contra células-alvo YAC1.

1	algarismo	3	4	5
		Np	RUPP	Np
0,615	0,484	0,473	0,463	0,471
0,586	0,484	0,458	0,474	0,469
0,61	0,486	0,464	0,459	0,469
0,605	0,55	0,524	0,526	0,543
0,576	0,504	0,519	0,502 0,528	00.528
0,565	0,512	0,515	0,513	0,531
0,563	0,581	0,526	0,508	0,519

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placa de cultura de tecidos de 96 poços	TRATAMENTO CELULAR	Rolamento 229190	Estéril, fundo redondo
Raspador de células	pescador	8100241
Kit de ensaio de citotoxicidade não radioativa Cytotox 96	Promega	G1780
RPMI	Gibco	11875135	1640 Médio
Célula YAC-1	ATCC	TIB-160