1. Síntese de triacrilato de policaprolactona (PCLTA)
- Secar 3,2 ml de triol de policaprolactona (PCL) 400 Da durante a noite a 50 °C num balão aberto de fundo redondo de 200 ml e carbonato de potássio (K2CO3) num frasco de vidro a 90 °C.
- Misturar o triol com 6,4 ml de diclorometano (DCM) e 4,246 g de K2CO3 sob o teor de árgon.
- Misture 2,72 mL de cloreto de acriloil em 27,2 mL de DCM e adicione gota a gota à mistura de reação no frasco durante 5 min.
- Cubra a mistura de reação com papel alumínio e deixe-a intacta em temperatura ambiente por 24 h sob argônio.
- Após 24 h, filtrar a mistura de reacção com um papel de filtro num funil de Buchner sob vácuo para eliminar o excesso de reagentes.
- Precipitar o filtrado do passo 1.5 que contém o polímero terminado em éter dietílico a 1:3 (vol/vol) e rotavap a 30 °C para remover o éter dietílico.
2. Formação da polibolha
NOTA: A injeção de polímero na água deionizada (DI) faria com que as polibolhas migrassem para o fundo do frasco, resultando em fundo achatado. Use 10% (peso / vol) de carboximetilcelulose (CMC) para encher o frasco de vidro para evitar o achatamento de bolhas.
- Prepare a solução de CMC a 10% (peso / vol) em água DI.
- Encha um frasco de vidro de 0,92 mL com 0,8 mL de CMC a 10% usando uma pipeta de transferência de 1 mL.
- Misture 1000 mg / mL de 14 kDa PCL em DCM e sintetize PCLTA em 1: 3 (vol / vol) para um volume total de 200 μL ou prepare 200 μL de 1000 mg / mL de 5 kDa poli (ácido lático-co-glicólico) diacrilato (PLGADA) em clorofórmio.
- Misturar a 2-hidroxi-4′-(2-hidroxietoxi)-2-metilpropiofenona (fotoiniciador) com a mistura de polímeros (PLGADA ou PCL/PCLTA) a 0,005:1 (vol/vol).
- Carregue 200 μL de mistura de polímeros em uma seringa de vidro de 1 mL montada em uma bomba de seringa conectada a um tubo de distribuição de aço inoxidável com diâmetro interno de 0,016 polegada.
- Use um micromotor para controlar o movimento para frente e para trás do tubo de polímero para injetar polímero no CMC a 10% no frasco de vidro para formar a polibolha.
- Catalise as polibolhas sob ultravioleta (UV) no comprimento de onda de 254 nm por 60 s a 2 W / cm2.
- Congele rapidamente as polibolhas em nitrogênio líquido e liofilize durante a noite a 0,010 mBar de vácuo e a -85 °C.
- Separe as bolhas do CMC seco usando uma pinça e lave as bolhas com água DI para remover qualquer CMC residual. Observe que outros polímeros podem ser usados provavelmente com modificações para alterar a cinética de liberação.
3. Modulação do diâmetro das polibolhas
- Encha um frasco de vidro de 0,92 mL com 10% de CMC usando uma pipeta de transferência de 1 mL.
- Misture PCL / PCLTA em 1: 3 (vol / vol) com 1000 mg / mL 14kDa PCL e sintetize PCLTA. Misturar o fotoiniciador com uma mistura de polímeros a 0,005:1 (vol/vol).
- Carregue a mistura de polímeros em uma seringa de vidro de 1 mL montada em uma bomba de seringa conectada a um tubo de aço inoxidável dispensador com diâmetro interno de 0,016 polegada.
- Use um micromotor para controlar o movimento para frente e para trás do tubo de polímero para injetar polímero no CMC a 10% no frasco de vidro para formar a polibolha.
- Para obter polibolhas com vários diâmetros, varie a taxa de dispensação de 0,0005 a 1 μL/s.
- Tire imagens do frasco com as polibolhas com diâmetro variável.
- Use ImageJ para quantificar o diâmetro das polibolhas e use o tamanho do frasco como escala.
4. Centralização da carga dentro do polybubble
- Modulação da viscosidade PCL/PCLTA usando K2CO3:
nota: A viscosidade do PLGADA não precisa ser modificada usando K2CO3 porque a viscosidade de 5 kDa PLAGDA a 1000 mg/mL é suficiente para centralizar a carga.
- Adicione K2CO3 (que foi isolado após a reação de PCLTA) ao PCLTA em concentrações variadas, incluindo 0 mg / mL, 10 mg / mL, 20 mg / mL, 40 mg / mL e 60 mg / mL.
- Meça as viscosidades dinâmicas das soluções alterando a taxa de cisalhamento de 0 a 1000 1/s usando reometria.
- Injetar manualmente a carga no meio (ver passo 4.2 para preparar a mistura de carga) das polibolhas que se formaram utilizando as soluções PCL/PCLTA com diferentes concentrações de K2CO3 (passo 4.1.1). Determinar a concentração óptima de K2CO3 observando qual a solução do passo 4.1.1 que pode resultar na retenção da carga no meio.
- Centralização da carga (já demonstrada viabilidade com pequenas moléculas) com CMC
- Misture a carga com 5% (peso / vol) de CMC em um rotador durante a noite para aumentar a viscosidade da carga.
- Injete manualmente 2 μL de mistura de carga no polybubble e prossiga com a cura UV no comprimento de onda de 254 nm por 60 s a 2 W/cm2.
- Congelar rapidamente as polibolhas em nitrogênio líquido por 30 s e liofilizar durante a noite a 0,010 mBar de vácuo e a -85 ° C.
- Separe as bolhas de polibolhas do CMC seco usando uma pinça e lave com água DI para remover qualquer CMC residual.
- Corte a polibolha ao meio e faça a imagem das metades usando microscopia confocal para garantir que a carga esteja centralizada (consulte a etapa 6 para obter os comprimentos de onda de excitação e emissão usados).
5. Formulação de Carga
NOTA: A formulação Polybubble pode abrigar vários tipos de carga, incluindo pequenas moléculas, proteínas e ácidos nucléicos.
- Com base em estudos anteriores, no caso de carga de proteínas, use excipientes, incluindo polietilenoglicol (PEG), polivinilpirrolidona (PVP) e glicopolímeros para melhorar a estabilidade da proteína durante a formulação de polibolhas.
- Forme polibolhas com base no protocolo da etapa 2.
- Prepare a solução de antígeno adicionando 17,11 g de trealose a 625 μL de antígeno gp120/41 do HIV.
- Injete manualmente 1 μL de solução de antígeno no meio da polibolha.
- Abra as polibolhas nos dias 0, 7, 14 e 21 e registre a fluorescência do antígeno com comprimentos de onda de excitação e emissão de 497 nm e 520 nm, respectivamente.
- Determine a funcionalidade do antígeno usando ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) e use leite desnatado a 5% como tampão de bloqueio.
6. Libertação da carga
NOTA: Pequena molécula ou antígeno pode ser usado como tipo de carga
- Molécula pequena
- Incubar polibolhas com acriflavina centrada em 400 μL de tampão fosfato salino (PBS) a 37 °C, 50 °C para polibolhas de PLGADA e a 37 °C, 50 °C, 70 °C para polibolhas de PCL/PCLTA.
nota: A razão pela qual recomendamos testar acima da temperatura corporal é a) simular a temperatura (50 ° C) na qual a polibolha atinge durante o laser dos nanobastões de ouro (AuNRs) dentro do PCL e PLGA; e b) acelerar o processo de degradação do PCL (50 °C, 70 °C).
- Em cada momento, recolher os sobrenadantes e substituí-los por 400 μL de PBS fresco.
- Use um leitor de placas para quantificar as intensidades de fluorescência nos sobrenadantes coletados.
nota: Utilizar ex/em de 416 nm/514 nm para a acriflavina.
- antígeno
- Incubar polibolhas com soro de albumina bovina centrado (BSA)-488 em 400 μL de PBS a 37 °C, 50 °C para polibolhas PLGADA e a 37 °C, 50 °C para polibolhas PCL/PCLTA.
- Em cada momento, recolher os sobrenadantes e substituí-los por 400 μL de PBS fresco.
- Use um leitor de placas para quantificar as intensidades de fluorescência nos sobrenadantes coletados. Use ex/em de 497 nm/520 nm para BSA-488.
nota: Não se deve realizar um estudo de libertação a 70 °C para as polibolhas de PCL/PCLTA para evitar a exposição do antigénio a temperaturas extremas.