Um ensaio para avaliar os efeitos anticancerígenos do sobrenadante livre de células de Lactobacillus

Resumo

Fonte: Lee, J., et al. Avaliando a morte celular usando sobrenadante livre de células de probióticos em culturas esferóides tridimensionais de células de câncer colorretal. J. Vis. Exp. (2020).

Este vídeo demonstra um ensaio in vitro para estudar os efeitos anticancerígenos do sobrenadante livre de células de Lactobacillus (LCFS). Ao expor os esferóides do câncer colorretal a doses variadas de LCFS, a interação com os metabólitos bacterianos no LCFS induz apoptose nas células cancerígenas, interrompendo a estrutura esferóide e levando à morte celular de maneira dose-dependente.

Protocolo

1. Culturas de células bacterianas e preparação de sobrenadante livre de células de Lactobacillus (LCFS)

NOTA: As etapas 1.2 – 1.9 são realizadas em uma câmara anaeróbica.

1. Prepare um prato de ágar De Man-Rogosa-Sharpe (MRS) e caldo contendo L-cisteína e esterilize em autoclavagem.
2. Pré-incubar a placa de ágar MRS em câmara anaeróbia H₂ mantida a 37 °C com 20 ppm de oxigénio.
3. Descongelar o estoque bacteriano de Lactobacillus e inocular a placa de ágar com a cultura bacteriana (Figura 1A (i)).
4. Incubar bactérias durante 2 a 3 dias em câmara anaeróbica H₂ a 37 °C e 20 ppm de oxigénio até obterem colónias bacterianas únicas.
5. Lave e seque o tubo de cultura anaeróbica tipo Hungate. Autoclave o tubo de cultura a 121 °C durante 15 min.
6. Em seguida, incubar o tubo em câmara anaeróbia H₂ a 37 °C e 20 ppm de oxigénio para remover o oxigénio.
7. Coloque 2 a 3 mL de caldo MRS no tubo. Sele o tubo com uma rolha de borracha butílica e aperte a tampa.
8. Obtenha uma única colônia com uma alça e coloque-a no tubo de cultura de 1,5 mL com 500 μL de 1x PBS. (Figura 1A (ii)).
9. Suspenda a colônia usando uma seringa de 1 mL (Figura 1A (iii)). Faça isso inserindo a agulha da seringa de 1 mL no centro da tampa do tubo, aspirando a colônia suspensa e, em seguida, ressuspendendo-a de volta no meio de caldo MRS. (Figura 1A (iv)).
10. Incube o meio de caldo MRS em uma incubadora agitadora por 2 dias (37 ° C, 5% CO₂, 200 rpm).
11. Meça a densidade óptica (OD) usando um espectrofotômetro para monitorar as curvas de crescimento bacteriano até que a absorbância em OD₆₂₀ atinja 2,0.
12. Separe os pellets bacterianos e os meios condicionados centrifugando a 1.000 x g por 15 min. Lave os pellets bacterianos coletados com 1x PBS e ressuspenda em 4 mL de RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino. Não inclua nenhum antibiótico no meio.
13. Manter os pellets bacterianos em RPMI e incubar numa incubadora agitadora durante 4 h a 37 °C com 5% de CO₂ a uma velocidade de 100 rpm.
14. Para a preparação do sobrenadante probiótico, remova o pellet bacteriano por centrifugação a 1000 x g, por 15 min a 4 ° C. Filtre estéril o sobrenadante recuperado usando um filtro de 0,22 μm e armazene a -80 ° C até o uso.

2. Geração de esferoides

1. Preparação de linhagens celulares de câncer colorretal
   1. Cultive as linhagens celulares DLD-1, HT-29 e WiDr como monocamadas até 70-80% de confluência e incube a placa a 37 ° C em uma incubadora de 5% de CO₂ (meio de crescimento: RPMI contendo 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina-estreptomicina).
   2. Para células cultivadas em placa de Petri de 100 mm, lave a placa duas vezes com 4 mL de 1x PBS. Adicione 1 mL de tripsina-EDTA a 0,25% e incube a placa de Petri por 2 min a 37 ° C em uma incubadora de CO_{5 a 5}% 2 para dissociar as células.
   3. Após a incubação, verifique a dissociação celular ao microscópio e neutralize a tripsina-EDTA com 5 mL de meio de crescimento.
   4. Transfira as células dissociadas para um tubo cônico de 15 mL e centrifugue por 3 min a 300 x g.
   5. Descarte o sobrenadante e ressuspenda suavemente com 3 mL de meio de crescimento.
   6. Conte as células com azul de tripano para determinar as células viáveis usando um hemocitômetro. (Figura 1B (i))
2. Formação de esferóides
   1. Em um tubo cônico de 15 mL, diluir as células de 2,1.5 para obter 1 - 2 x 10⁵ células/mL (Figura 1B (ii))
   2. Adicione a concentração final de metilcelulose a 0,6% à suspensão celular e transfira as células diluídas para um reservatório estéril.
      NOTA: Para cada linha celular, a quantidade de metilcelulose necessária deve ser titulada e determinada de acordo.
   3. Use uma pipeta multicanal para dispensar 200 μL de células para cada poço de uma microplaca de fundo redondo de 96 poços de fixação ultrabaixa. (Figura 1B (iii))
   4. Incubar a placa a 37 °C em uma incubadora de CO₂ a 5% por 24 a 36 h.
   5. Após 24 - 36 h, observe a placa sob um microscópio óptico para garantir a formação de esferóides.

3. Tratamento de células cancerígenas colorretais 3D com LCFS

1. Gere esferoides conforme descrito nas etapas 2 e 3.
2. Antes de realizar o tratamento LCFS, descongele o LCFS congelado à temperatura ambiente (RT) por 10 a 20 min.
3. Inocular a solução-mãe LCFS num meio de cultura. Diluir em série para 25%, 12,5% e 6% no meio de crescimento (ou seja, 25% LCFS = 150 μL de meio de crescimento + 50 μL de LCFS).
4. Retirar a placa de cultura de células contendo esferóides da incubadora e remover o máximo possível do meio de cultura de cada alvéolo com uma pipeta de 200 μl.
5. Adicione o meio de crescimento com LCFS nas células e incube a 37 °C em uma incubadora de CO_{5% 2} por 24 a 48 h.
   nota: O volume a ser utilizado dependerá do tamanho da placa da seguinte forma: 2 mL para placas de cultura de células de 6 poços; 200 μL para placas de cultura de células de 96 poços.

Resultados

Figura 1: Representação esquemática da formação de esferóides e preparação do LCFS.

(A) As imagens de representação esquemática do protocolo de geração LCFS são marcadas por (i-iv) (B) Os esquemas da formação de esferóides mediada por metilcelulose são marcados por (i-iii).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Filme adesivo óptico MicroAmp da Applied Biosystems	Thermo Fisher Científico	4311971	100 capas
Tubo de Microcentrífuga MaxyClear Snaplock Axygen 2.0 mL, Polipropileno, Transparente, Não Estéril, 500 Tubos/Pacote, 10 Pacotes/Caixa	Corning	SCT-200-C	500 tubos/bloco, 10 blocos/caixa
Ágar BD Difco Bacto	Bd	Rolamento 214010	500 gramas
Caldo BD Difco Lactobacilos MRS	Bd	DF0881-17-5	500 gramas
Corning Phosphate-Buffered Saline, 1X sem cálcio e magnésio, PH 7,4 ± 0,1	Corning	21-040-CV	500 mL
Tubo de Ensaio de Poliestireno de Fundo Redondo Falcon 5 mL, com Tampa de Pressão do Filtro de Células	Corning	352235	25/Pack, 500/Case
Soro fetal bovino, certificado, origem americana	Thermo Fisher Científico	16000044	500 mL
Lactobacillus fermentum	Coleção coreana para culturas de tipo	KCTC 3112
Cloridrato de L-cisteína mono-hidratado	Sigma-Aldrich	C6852-25G	25 gramas
Metilcelulose (3500-5600mPa·s, 2% em água a 20°C)	TCI	M0185	500 gramas
Placa de reação óptica rápida de 96 poços MicroAmp com código de barras, 0,1 mL	Biossistemas Aplicados	4346906	20 pratos
Unidade de filtro de seringa Millex-GS, 0,22 μm, ésteres de celulose mistos, 33 mm, esterilizado por óxido de etileno	Millipore	SLGS033SB	250
Penicilina-estreptomicina (10.000 U/mL)	Thermo Fisher Científico	15140122	100 mL
RPMI-1640	Gibco	11875-119	500 mL
Tripsina-EDTA (0,25%), vermelho de fenol	Thermo Fisher Científico	25200056	100 mL
Materiais/Equipamentos/Software
Incubadora de CO2	Pescador térmico	HERAcell 150i
Tubo cônico 15 ml	Spl	50015
Tubo cônico 50 ml	Spl	Rolamento 50050
Placa de poços múltiplos de fixação ultrabaixa Corning Costar	Sigma-Aldrich	CLS7007
Placa de poços múltiplos de fixação ultrabaixa Corning Costar	Sigma-Aldrich	CLS3471
Reservatórios de Reagentes Costar 50 mL, 5/Saco, Estéril	Costar	Nº 4870
Lâminas de Câmara de Contagem de Células Condessa	Thermofisher	C10228
Contador de Células Automatizado Countess II FL	invitrogen	AMQAF1000
Leitor multimodo EnSpire	Perkin Elmer		Inspirar 2300
Eppendorf Research Plus Pipeta Multicanal, 8 canais	Eppendorf	3122000051
Agitador incubado	Companheiro de laboratório	SIF-6000R
Multi Gauge Ver. 3.0,	Fujifilm		Tóquio, Japão
Densidade óptica (OD)Espectrofotômetros LAMBDA UV/VIS	Perkin Elmer		Waltham, MA, EUA
Microscópio de contraste de fase	Olimpo		Tóquio, Japão
Tubo de microcentrífuga SPL 1,5mL	Spl	Nº 60015
Reservatórios multicanal SPL, 12 canais, PS, estéreis	Spl	21012
Processadores de líquidos ultrassônicos Vibra-Cell	Célula SONICS-vibra	VC 505	Processador ultrassônico de 500 watts
Câmara anaeróbica de vinil	PRODUTOS COY LAB