Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Processamento do Sangue do Cordão Umbilical e o Isolamento de Células-Tronco/Progenitoras Hematopoiéticas Humanas (HSPCs)
- Execute todas as etapas do protocolo em condições estéreis em gabinetes de fluxo laminar.
- Pegue o sangue do cordão umbilical (CB) coletado em tubos heparinizados e faça o volume até 35 mL adicionando solução salina tamponada com fosfato (PBS). Coloque a amostra em camadas sobre o meio de separação de linfócitos (LSM) conforme ilustrado na Figura 1 e centrifugue o LSM com o CB em camadas a 400 x g por 35 min a 4 ° C sem freios.
nota: Dilua o sangue com cuidado e suavidade para evitar a mistura na interface.
- Remova o LSM superior e a camada de plasma com cuidado e transfira a interface do revestimento leucocitário branco para um novo tubo usando uma pipeta de transferência.
- Ressuspenda o revestimento leucocitário em 30 - 40 mL de tampão gelado (PBS + 0,5% de albumina de soro bovino [BSA] + 2 mM de ácido etilenodiaminotetracético [EDTA]). Usando uma pipeta, combine 20 μL da suspensão celular com 20 μL de azul de tripano a 0,4% e pipete 10 μL da mistura na abertura externa de qualquer uma das duas câmaras de uma lâmina de contagem e insira a lâmina em um contador de células automatizado para contar as células.
nota: Use tampão gelado em todas as etapas, pois ajuda a manter as células viáveis.
- Centrifugar as células a 300 x g durante 10 min a 4 °C e aspirar cuidadosamente o sobrenadante. Em seguida, adicione 300 μL de tampão gelado.
- Adicione 100 μL de reagente bloqueador do receptor Fc humano e 100 μL de microesferas conjugadas com anticorpos CD34 humanos de camundongo monoclonal para até 1 x 108 células (consulte a Tabela de Materiais). Incubar por 30 min a 4 ° C, adicionar 10 mL de tampão gelado para lavar as células e centrifugar a 300 x g por 10 min a 4 ° C.
NOTA: Aumente a escala de acordo com o número da célula se houver mais de 1 x 108 células.
- Remova cuidadosamente o sobrenadante, ressuspenda o pellet em 500 μL de tampão e prossiga com a etapa de separação magnética para enriquecer os HSPCs.
- Coloque uma coluna LS de seleção positiva (consulte a Tabela de Materiais) no campo de classificação de células ativadas por magnetismo e passe-a com 3 mL de tampão.
- Carregue a amostra na coluna LS que pode prender microesferas ligadas ao CD34+ humano em amostras e permitir que ela flua sob a influência da gravidade para o tubo de coleta.
- Lavar a coluna 3x com tampão e recolher o eluimento no mesmo tubo de recolha da fracção CD34- das células.
- Mergulhe a coluna com 5 mL de tampão para eluir as células CD34+ em um novo tubo de coleta. Repita o procedimento para obter uma pureza de >90%.
- Conte as células CD34 + eluídas usando corante azul de tripano em um hemocitômetro. Após a contagem, centrifugue as células CD34+ a 300 x g durante 5 min e elimine o sobrenadante.
- Ressuspenda as células CD34+ em 25 μL de PBS para uma injeção a ser usada imediatamente no transplante ou criopreserve as células a uma concentração de 1-2 milhões/mL em meio de congelamento (meio do Roswell Park Memorial Institute [meio RPMI 1640] + 50% de soro fetal bovino (FBS) + 10% de dimetilsulfóxido [DMSO]) para uso posterior em transplante.
nota: Sempre reconte as células viáveis antes de usá-las no transplante.
- Para verificar a pureza do eluidor CD34+, pegue 50 μL da suspensão e incube-a com 10 μL de ficoeritrina ou anticorpo anti-CD34 humano conjugado com PE por 30 min a 4 °C. Após a incubação do anticorpo, lave as células coradas com PBS, ressuspenda-as em 100 μL de PBS e, em seguida, prossiga para realizar a citometria de fluxo. Adicione um tubo adicional de células sem anticorpo para projetar a porta no citômetro de fluxo.
- Após a aquisição, analise os dados selecionando a região de interesse em um gráfico de dispersão direta (FSC) e dispersão lateral (SSC), seguido de gating para células únicas em gráficos de área FSC e altura FSC. Células CD34-positivas para porte em células únicas no canal PE e no gráfico da área SSC.
2. Preparação de Hepatócitos Humanos (HEPs) para Transplante
- Remova os hepatócitos criopreservados do nitrogênio líquido, mergulhe rapidamente o frasco no banho-maria e descongele por aproximadamente 90 a 120 s.
- Remova a tampa do frasco e despeje os hepatócitos descongelados no tubo cônico de 50 mL do meio de descongelamento aquecido.
- Suspenda as células balançando o tubo de 50 mL com a mão por alguns segundos.
nota: Não vórtice o tubo.
- Pulverize as células a 100 x g por 8 min em temperatura ambiente. Lave as células peletizadas em PBS com 0,1% de BSA e junte-as com HSPCs frescos ou descongelados (proporção de 10: 1) em PBS em um volume final de 80 μL / camundongo.
3. Manuseio, triagem, genotipagem e tratamento de animais para transplante humano de HSPC e hepatócitos
- Manejo de animais
- Como resultado de imunodeficiência grave, crie, aloje e manuseie camundongos TK-NOG em condições assépticas.
- Sempre use jaleco, luvas, capas de sapato e máscara facial para evitar infecção por microrganismos potencialmente patogênicos.
- Use luvas e instrumentos estéreis para a cirurgia e manuseie os animais assepticamente durante toda a cirurgia.
- Selecionando camundongos TK-NOG para o experimento
- Manter a colônia de cepas TK-NOG cruzando camundongos TK-NOG fêmeas com irmãos machos não-TK-NOG e selecionar descendentes transgênicos por genotipagem.
nota: Realize a genotipagem (consulte a etapa 3.3) para determinar a presença ou ausência do transgene em camundongos machos e fêmeas recém-nascidos no momento do desmame.
- Selecione homens com 6 a 8 semanas de idade para transplante devido à sua alta sensibilidade à depleção mediada por GCV de hepatócitos que expressam o transgene HSV-TK.
- Marca de orelha nos camundongos no momento do desmame ou cirurgia para facilitar a identificação. Anote o peso e o estado de saúde dos animais.
- Genotipagem da presença do transgene HSV-TK por meio de reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real
- Realize a genotipagem no momento do desmame (geralmente entre 3 e 4 semanas de idade). Para a genotipagem, corte um pedaço da orelha do rato em um gabinete de segurança biológica de fluxo laminar para manter a esterilidade e extrair o DNA genômico usando um kit de isolamento de DNA genômico.
- Amplificar o DNA genômico extraído do fone de ouvido em uma mistura de reação de 20 μL para rastrear o transgene HSV-TK sob controle do promotor de albumina humana adicionando 1 μL de primer direto 5'-CCATGCACGTCTTTATCCTGG-3', 1 μL de primer reverso 5'-TAAGTTGCAGCAGGGCGTC-3', 0,5 μL de sonda FAM 5′-FAM-AATCGCCCGCCGGCTGC-MGB-3', e 10 μL de master mix em um instrumento de reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real.
- Defina as configurações de PCR em tempo real da seguinte forma: 60 °C por 30 s (estágio de pré-leitura), 95 °C por 10 min (estágio de espera), 40 ciclos de 95 °C por 15 s e 60 °C por 1 min (estágio de PCR) e 60 °C por 30 s (estágio de pós-leitura).
nota: Um ciclo de limiar (Ct) abaixo de 22 é considerado positivo para o transgene HSV-TK.
- Tratamento com ganciclovir e treosulfan
- Usando agulha 27 G, injete os camundongos TK-NOG com injeções intraperitoneais de GCV (6 mg / kg) 2x ao dia no dia 7 e no dia 5 em 100 μL de solução salina antes da cirurgia para esgotar as células parenquimatosas transgênicas dos camundongos (conforme mostrado na estratégia experimental na Figura 2).
- Nos dias 3, 2 e 1 antes da cirurgia, pré-condicione os camundongos com doses intraperitoneais não mieloablativas de treosulfan (1,5 g / kg / dia) em 100 μL de solução salina, usando uma agulha de 27 G.
- Um dia antes da cirurgia, retire duas a três gotas (~ 100 μL) de sangue da veia submandibular picando-a com uma lanceta de 5 mm e isole o soro centrifugando (1.500 x g por 10 min a 4 ° C) para o ensaio de alanina aminotransferase (ALT) para avaliar o grau de dano hepático.
- Preparação para a cirurgia
- Use tesouras para raspar o pelo do camundongo ao redor do local da incisão (à esquerda da parede peritoneal) antes da cirurgia.
- Ajuste o fluxo de oxigênio para 1 L / min e o fluxo de isoflurano para 3% - 5% em uma câmara de indução usando uma máquina de anestesia de camundongo. Coloque um mouse de cada vez na câmara de indução para anestesia.
- Conecte uma extremidade de um tubo de extensão estéril (com capacidade de retenção de 550 μL de suspensão; consulte a Tabela de Materiais para especificações) a uma agulha de 30 G e a outra extremidade a uma seringa de 1 mL.
- Encha a seringa com a suspensão (80 μL/ratinho) de HEPs e HSPCs agrupados (ver secção 2), encaixe a seringa no entalhe de uma pipeta de distribuição repetitiva e ajuste o doseador para dispensar 10 μL em cada prensagem.
- Uma vez que os camundongos estejam anestesiados (geralmente após 3 a 4 minutos), mude o fluxo de isoflurano para o cone do nariz e reduza a taxa de fluxo de isoflurano para 2% a 3%.
- Transplante intraesplênico de HSPCs e hepatócitos humanos em camundongos
- Execute todas as etapas da cirurgia em um gabinete de fluxo laminar em condições estéreis.
- Colocar uma cortina estéril limpa sobre a superfície de trabalho e esfregar o lado esquerdo do corpo de cada rato com iodopovidona a 10 % seguido de álcool isopropílico a 70 %, antes de fazer uma incisão.
- Faça uma pequena incisão (~ 1 - 1,5 cm de comprimento e 5 mm de profundidade) na pele, músculo e peritônio à esquerda da parede peritoneal com uma tesoura tipo Vanna para entrar na cavidade peritoneal aproximadamente 5 mm abaixo da borda inferior da caixa torácica.
- Localize o baço, puxe-o levemente com uma pinça para a área de operação para facilitar o acesso e insira a agulha 30 G no polo inferior do baço.
- Destrave o êmbolo da pipeta dispensadora e dispense 10 μL do volume de cada vez, com um limite de 60-80 μL por baço. Retraia a agulha lentamente e prenda o baço com clipes de ligadura usando um aplicador de ligadura.
- Empurre o baço de volta para a cavidade corporal com aplicadores com ponta de algodão umedecidos com PBS estéril.
- Feche a camada muscular da parede abdominal usando um padrão de sutura interrompido por sutura absorvível (não contínuo). Realize o fechamento da pele com um padrão de sutura interrompido usando suturas não absorvíveis.
