Desenvolvendo um modelo de camundongo humanizado com células hepáticas humanas e células imunológicas

Abstract

Fonte: Dagur, R. S. et al., Estabelecimento do Modelo de Camundongo TK-NOG Humanizado Duplo para Patogênese Hepática Associada ao HIV.J. Vis. Exp.(2019)

Este vídeo demonstra um método para gerar um modelo de camundongo humanizado duplo com um sistema imunológico humano e células hepáticas. Envolve o transplante de células hepáticas humanas e células-tronco hematopoiéticas e progenitoras em um camundongo imunodeficiente transgênico por meio de injeção intraesplênica, levando ao enxerto de células hepáticas e ao desenvolvimento de células imunes humanas.

Protocol

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Processamento do Sangue do Cordão Umbilical e o Isolamento de Células-Tronco/Progenitoras Hematopoiéticas Humanas (HSPCs)

1. Execute todas as etapas do protocolo em condições estéreis em gabinetes de fluxo laminar.
2. Pegue o sangue do cordão umbilical (CB) coletado em tubos heparinizados e faça o volume até 35 mL adicionando solução salina tamponada com fosfato (PBS). Coloque a amostra em camadas sobre o meio de separação de linfócitos (LSM) conforme ilustrado na Figura 1 e centrifugue o LSM com o CB em camadas a 400 x g por 35 min a 4 ° C sem freios.
   nota: Dilua o sangue com cuidado e suavidade para evitar a mistura na interface.
3. Remova o LSM superior e a camada de plasma com cuidado e transfira a interface do revestimento leucocitário branco para um novo tubo usando uma pipeta de transferência.
4. Ressuspenda o revestimento leucocitário em 30 - 40 mL de tampão gelado (PBS + 0,5% de albumina de soro bovino [BSA] + 2 mM de ácido etilenodiaminotetracético [EDTA]). Usando uma pipeta, combine 20 μL da suspensão celular com 20 μL de azul de tripano a 0,4% e pipete 10 μL da mistura na abertura externa de qualquer uma das duas câmaras de uma lâmina de contagem e insira a lâmina em um contador de células automatizado para contar as células.
   nota: Use tampão gelado em todas as etapas, pois ajuda a manter as células viáveis.
5. Centrifugar as células a 300 x g durante 10 min a 4 °C e aspirar cuidadosamente o sobrenadante. Em seguida, adicione 300 μL de tampão gelado.
6. Adicione 100 μL de reagente bloqueador do receptor Fc humano e 100 μL de microesferas conjugadas com anticorpos CD34 humanos de camundongo monoclonal para até 1 x 10⁸ células (consulte a Tabela de Materiais). Incubar por 30 min a 4 ° C, adicionar 10 mL de tampão gelado para lavar as células e centrifugar a 300 x g por 10 min a 4 ° C.
   NOTA: Aumente a escala de acordo com o número da célula se houver mais de 1 x 10⁸ células.
7. Remova cuidadosamente o sobrenadante, ressuspenda o pellet em 500 μL de tampão e prossiga com a etapa de separação magnética para enriquecer os HSPCs.
8. Coloque uma coluna LS de seleção positiva (consulte a Tabela de Materiais) no campo de classificação de células ativadas por magnetismo e passe-a com 3 mL de tampão.
9. Carregue a amostra na coluna LS que pode prender microesferas ligadas ao CD34+ humano em amostras e permitir que ela flua sob a influência da gravidade para o tubo de coleta.
10. Lavar a coluna 3x com tampão e recolher o eluimento no mesmo tubo de recolha da fracção CD34^- das células.
11. Mergulhe a coluna com 5 mL de tampão para eluir as células CD34⁺ em um novo tubo de coleta. Repita o procedimento para obter uma pureza de >90%.
12. Conte as células CD34 ⁺ eluídas usando corante azul de tripano em um hemocitômetro. Após a contagem, centrifugue as células CD34⁺ a 300 x g durante 5 min e elimine o sobrenadante.
13. Ressuspenda as células CD34⁺ em 25 μL de PBS para uma injeção a ser usada imediatamente no transplante ou criopreserve as células a uma concentração de 1-2 milhões/mL em meio de congelamento (meio do Roswell Park Memorial Institute [meio RPMI 1640] + 50% de soro fetal bovino (FBS) + 10% de dimetilsulfóxido [DMSO]) para uso posterior em transplante.
    nota: Sempre reconte as células viáveis antes de usá-las no transplante.
14. Para verificar a pureza do eluidor CD34⁺, pegue 50 μL da suspensão e incube-a com 10 μL de ficoeritrina ou anticorpo anti-CD34 humano conjugado com PE por 30 min a 4 °C. Após a incubação do anticorpo, lave as células coradas com PBS, ressuspenda-as em 100 μL de PBS e, em seguida, prossiga para realizar a citometria de fluxo. Adicione um tubo adicional de células sem anticorpo para projetar a porta no citômetro de fluxo.
15. Após a aquisição, analise os dados selecionando a região de interesse em um gráfico de dispersão direta (FSC) e dispersão lateral (SSC), seguido de gating para células únicas em gráficos de área FSC e altura FSC. Células CD34-positivas para porte em células únicas no canal PE e no gráfico da área SSC.

2. Preparação de Hepatócitos Humanos (HEPs) para Transplante

1. Remova os hepatócitos criopreservados do nitrogênio líquido, mergulhe rapidamente o frasco no banho-maria e descongele por aproximadamente 90 a 120 s.
2. Remova a tampa do frasco e despeje os hepatócitos descongelados no tubo cônico de 50 mL do meio de descongelamento aquecido.
3. Suspenda as células balançando o tubo de 50 mL com a mão por alguns segundos.
   nota: Não vórtice o tubo.
4. Pulverize as células a 100 x g por 8 min em temperatura ambiente. Lave as células peletizadas em PBS com 0,1% de BSA e junte-as com HSPCs frescos ou descongelados (proporção de 10: 1) em PBS em um volume final de 80 μL / camundongo.

3. Manuseio, triagem, genotipagem e tratamento de animais para transplante humano de HSPC e hepatócitos

1. Manejo de animais
   1. Como resultado de imunodeficiência grave, crie, aloje e manuseie camundongos TK-NOG em condições assépticas.
   2. Sempre use jaleco, luvas, capas de sapato e máscara facial para evitar infecção por microrganismos potencialmente patogênicos.
   3. Use luvas e instrumentos estéreis para a cirurgia e manuseie os animais assepticamente durante toda a cirurgia.
2. Selecionando camundongos TK-NOG para o experimento
   1. Manter a colônia de cepas TK-NOG cruzando camundongos TK-NOG fêmeas com irmãos machos não-TK-NOG e selecionar descendentes transgênicos por genotipagem.
      nota: Realize a genotipagem (consulte a etapa 3.3) para determinar a presença ou ausência do transgene em camundongos machos e fêmeas recém-nascidos no momento do desmame.
   2. Selecione homens com 6 a 8 semanas de idade para transplante devido à sua alta sensibilidade à depleção mediada por GCV de hepatócitos que expressam o transgene HSV-TK.
   3. Marca de orelha nos camundongos no momento do desmame ou cirurgia para facilitar a identificação. Anote o peso e o estado de saúde dos animais.
3. Genotipagem da presença do transgene HSV-TK por meio de reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real
   1. Realize a genotipagem no momento do desmame (geralmente entre 3 e 4 semanas de idade). Para a genotipagem, corte um pedaço da orelha do rato em um gabinete de segurança biológica de fluxo laminar para manter a esterilidade e extrair o DNA genômico usando um kit de isolamento de DNA genômico.
   2. Amplificar o DNA genômico extraído do fone de ouvido em uma mistura de reação de 20 μL para rastrear o transgene HSV-TK sob controle do promotor de albumina humana adicionando 1 μL de primer direto 5'-CCATGCACGTCTTTATCCTGG-3', 1 μL de primer reverso 5'-TAAGTTGCAGCAGGGCGTC-3', 0,5 μL de sonda FAM 5′-FAM-AATCGCCCGCCGGCTGC-MGB-3', e 10 μL de master mix em um instrumento de reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real.
   3. Defina as configurações de PCR em tempo real da seguinte forma: 60 °C por 30 s (estágio de pré-leitura), 95 °C por 10 min (estágio de espera), 40 ciclos de 95 °C por 15 s e 60 °C por 1 min (estágio de PCR) e 60 °C por 30 s (estágio de pós-leitura).
      nota: Um ciclo de limiar (Ct) abaixo de 22 é considerado positivo para o transgene HSV-TK.
4. Tratamento com ganciclovir e treosulfan
   1. Usando agulha 27 G, injete os camundongos TK-NOG com injeções intraperitoneais de GCV (6 mg / kg) 2x ao dia no dia 7 e no dia 5 em 100 μL de solução salina antes da cirurgia para esgotar as células parenquimatosas transgênicas dos camundongos (conforme mostrado na estratégia experimental na Figura 2).
   2. Nos dias 3, 2 e 1 antes da cirurgia, pré-condicione os camundongos com doses intraperitoneais não mieloablativas de treosulfan (1,5 g / kg / dia) em 100 μL de solução salina, usando uma agulha de 27 G.
   3. Um dia antes da cirurgia, retire duas a três gotas (~ 100 μL) de sangue da veia submandibular picando-a com uma lanceta de 5 mm e isole o soro centrifugando (1.500 x g por 10 min a 4 ° C) para o ensaio de alanina aminotransferase (ALT) para avaliar o grau de dano hepático.
5. Preparação para a cirurgia
   1. Use tesouras para raspar o pelo do camundongo ao redor do local da incisão (à esquerda da parede peritoneal) antes da cirurgia.
   2. Ajuste o fluxo de oxigênio para 1 L / min e o fluxo de isoflurano para 3% - 5% em uma câmara de indução usando uma máquina de anestesia de camundongo. Coloque um mouse de cada vez na câmara de indução para anestesia.
   3. Conecte uma extremidade de um tubo de extensão estéril (com capacidade de retenção de 550 μL de suspensão; consulte a Tabela de Materiais para especificações) a uma agulha de 30 G e a outra extremidade a uma seringa de 1 mL.
   4. Encha a seringa com a suspensão (80 μL/ratinho) de HEPs e HSPCs agrupados (ver secção 2), encaixe a seringa no entalhe de uma pipeta de distribuição repetitiva e ajuste o doseador para dispensar 10 μL em cada prensagem.
   5. Uma vez que os camundongos estejam anestesiados (geralmente após 3 a 4 minutos), mude o fluxo de isoflurano para o cone do nariz e reduza a taxa de fluxo de isoflurano para 2% a 3%.
6. Transplante intraesplênico de HSPCs e hepatócitos humanos em camundongos
   1. Execute todas as etapas da cirurgia em um gabinete de fluxo laminar em condições estéreis.
   2. Colocar uma cortina estéril limpa sobre a superfície de trabalho e esfregar o lado esquerdo do corpo de cada rato com iodopovidona a 10 % seguido de álcool isopropílico a 70 %, antes de fazer uma incisão.
   3. Faça uma pequena incisão (~ 1 - 1,5 cm de comprimento e 5 mm de profundidade) na pele, músculo e peritônio à esquerda da parede peritoneal com uma tesoura tipo Vanna para entrar na cavidade peritoneal aproximadamente 5 mm abaixo da borda inferior da caixa torácica.
   4. Localize o baço, puxe-o levemente com uma pinça para a área de operação para facilitar o acesso e insira a agulha 30 G no polo inferior do baço.
   5. Destrave o êmbolo da pipeta dispensadora e dispense 10 μL do volume de cada vez, com um limite de 60-80 μL por baço. Retraia a agulha lentamente e prenda o baço com clipes de ligadura usando um aplicador de ligadura.
   6. Empurre o baço de volta para a cavidade corporal com aplicadores com ponta de algodão umedecidos com PBS estéril.
   7. Feche a camada muscular da parede abdominal usando um padrão de sutura interrompido por sutura absorvível (não contínuo). Realize o fechamento da pele com um padrão de sutura interrompido usando suturas não absorvíveis.

Results

Figura 1: Esquema do enriquecimento de células CD34⁺ do sangue do cordão umbilical.(A) O sangue do cordão umbilical é colocado em camadas no meio de separação de linfócitos (LSM) e centrifugado para isolar o revestimento leucocitário. (B) As colunas LS são colocadas em um suporte magnético e enxaguadas com um tampão BSA, seguidas pela adição de uma camada ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agulhas 27G1/2"	BD biociências	305109
30G1/2" agulhas	BD biociências	305106
Tubo de poliestireno de 5 mL com fundo redondo estilo 12 x 75 mm	Corning	352054
Seringa de tuberculina BD 1 mL sem agulha	BD biociências	309659
Bioanalisador de matriz BD FACS	BD Biociências		Para verificação da pureza de células CD34+ eluídas
Software de matriz BD FACS	BD Biociências		Software para análise de célula CD34+ adquirida em matriz FACS
Solução de lise BD FACS	BD Biociências	349202	Para lisar os glóbulos vermelhos
BD LSR II	BD Biociências		Instrumento para aquisição de amostras de citometria de fluxo
Tubo de coleta de sangue de plástico BD Vacutainer	BD biociências	BD 367874	Para coletar sangue do cordão umbilical
Albumina de soro bovino	Sigma-aldrich	Rolamento A9576
Kit CD34 MicroBead, humano	Miltenyi Biotec	130-046-702	Para isoação de CD34+ HSPC
CD34-PE humano	Miltenyi Biotec	130-081-002	Anticorpo usado para verificação de pureza de células CD34+ eluídas
Lâminas de contagem de células	Bio-rad	1450015
Kit de Mini Tecido ChargeSwitch gDNA	Thermofisher científico	CS11204	Para extração de DNA genômico do fone de ouvido
Aplicadores com ponta de algodão	McKesson	24-106-2S
DMSO (dimetilsulfóxido)	Sigma-aldrich	D2650-5X5ML
Conjunto de extensão Microbore Slide Clamp(s) Fixed Male Luer Lock. L: 60 pol L: 152 cm PV: 0,55 mL Caminho do fluido estéril	BD biociências	Rolamento 30914	Anexado ao pipeto de distribuição e à carga com HSPC e HEP suspesion
FACS Diva versão 6	BD Biociências		Software de citômetro de fluxo necessário para aquisição da amostra
Soro fetal bovino (FBS)	Gibco	10438026
Software de análise FLOWJO v10.2	FLOWJO, LLC		Software de análise de citometria de fluxo
Ganciclovir	APP Farmacêutica, Inc.	Rolamento 315110	Medicamento de prescrição
Tubos de EDTA Greiner MiniCollect	Greiner bio-one	450475
Meio de descongelamento de hepatócitos	Laboratórios de Pesquisa do Triângulo	MCHT50
Aplicadores de clipe de ligação do Horizon Open	Teleflex	537061	Para segurar os clipes de ligação
Hepatócito humano	Laboratórios de Pesquisa do Triângulo	HUCP1	Hepatócitos humanos criopreservados, qualificados para indução
Tesoura de íris, reta	Ted Pella, Inc.	13295
lanceta	MEDIpoint	Goldenrod 5 milímetros
Colunas LS	Miltenyi Biotec	130-042-401	Usado para prender microesferas CD34+ (seleção positiva)
Meio de Separação de Linfócitos (LSM)	MP Biomédicos	Rolamento 50494	Para isoação de linfócitos do sangue periférico
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303	Contém colunas separadas e LS do Qudro MACS
Tesoura de Mola Micro Dissecadora McPherson-Vannas	Roboz Instrumento Cirúrgico Co.	RS-5605	Usado para fazer uma incisão na pele para expor o baço
Micro fórceps de dissecação	Roboz Instrumento Cirúrgico Co.	RS-5157	Para segurar e retirar o baço da cavidade peritoneal
Mouse CD45-FITC	BD Biociências	Rolamento 553080	Específico do mouse
PBS (solução salina tamponada com fosfato)	Hyclone	SH30256.02
Separador Qudro MACS	Miltenyi Biotec	130-090-976	contém quatro colunas LS
RPMI 1640 médio	Gibco	11875093
PCR em tempo real StepOne Plus	Biossistemas Aplicados		Instrumento utilizado para genotipar
Pipeta de Distribuição Repetitiva Série Stepper 1ml	DYMAX CORP	T15469	Usado para dispensar a suspensão de HSPC e HEP de maneira controlada
Mistura Mestre de Expressão Gênica TaqMan	Thermofisher científico	4369016
Contador de células automatizado TC20	Bio-rad	1450102
Ratos TK-NOG			Fornecido pelo Instituto Central de Animais Experimentais (CIEA, Japão; Drs. Mamoru Ito e Hiroshi Suemizu)
Treosulfan	Medac GmbH		Fornecido pelo Dr. Joachim Baumgart (medac GmbH)
Azul Trypan	Bio-rad	1450022
Micro Tesoura tipo Vannas, reta, 80mm L	Ted Pella, Inc.	1346	Usado para fazer uma incisão na pele para expor o baço
Weck hemoclip clipes de ligação de titânio tradicionais	Esturas	Rolamento 523700	Para ligar o baço após a injeção