Uma técnica para a geração de células T CAR específicas para antígenos

Resumo

Fonte: Davidson, H. W., et al. Geração de alta eficiência de células T citotóxicas primárias de camundongo específicas para antígenos para testes funcionais em um modelo de diabetes autoimune. J. Vis. Exp. (2019).

Este vídeo demonstra uma técnica para gerar células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) específico do antígeno por meio de transdução retroviral. As células T CD8+ murinas ativadas são adicionadas a uma placa de micropoços revestida com fragmentos de fibronectina recombinante. Vetores retrovirais contendo RNA transgênico que codifica um receptor de antígeno quimérico específico do antígeno (CAR) são então introduzidos e a placa é centrifugada para facilitar a transdução. Após a incubação, as células transduzidas expressam CARs específicos do antígeno em sua superfície.

Protocolo

1. Geração e validação de anticorpo Fab de cadeia única (scFab)-CARs.

NOTA: Os CARs normalmente contêm 3 domínios críticos - um domínio de direcionamento de antígeno, um domínio espaçador/transmembrana e um domínio de sinalização citoplasmática. O projeto preciso de cada CAR depende do alvo pretendido e, portanto, além das principais características da construção relevantes para a geração do retrovírus, não será descrito em detalhes neste protocolo. O desenho geral dos CARs usados para os estudos descritos abaixo é mostrado na Figura 1. Em resumo, o domínio de direcionamento compreende toda a cadeia leve e variável e o domínio CH1 da cadeia pesada do anticorpo monoclonal original ligado por um ligante semirrígido. O domínio espaçador/transmembrana é de CD28 de camundongo, e o domínio de sinalização é uma fusão contendo elementos de CD28, CD137 (4-1BB) e CD247 de camundongo (CD3ζ). Esses elementos são montados por procedimentos padrão de biologia molecular, como reação em cadeia da polimerase (PCR) de sobreposição de emenda ou a síntese de um "bloco genético" apropriado. Detalhes da geração do mAB287 CAR estão contidos em Zhang et al. As sequências de cDNA podem ser obtidas com os autores mediante solicitação.

1. Montando a construção CAR
   1. Sintetize o anticorpo Fab de cadeia única (scFab) e os domínios espaçadores/sinalizadores combinados separadamente e use uma técnica de ligação de "3 pontos" para montar a construção final (Figura 1).
      NOTA: O principal requisito para a inserção do CAR é que ela contenha locais de endonuclease de restrição flanqueadores que permitam a ligação ao vetor de expressão retroviral pMSCV-IRES-GFP II (pMIG II) ou um derivado relacionado também são apropriados.
2. Validação da expressão da superfície CAR
   1. Transduza as células do hibridoma usando partículas retrovirais derivadas de pMIG II geradas por um protocolo padrão (por exemplo, Holst et al.).
   2. Execute a análise de citometria de fluxo para detectar a expressão de GFP do vetor CAR.
   3. Expressão da superfície da mancha do CAR dos hibridomas transduzidos usando anticorpos marcados contra a cadeia κ do camundongo (por exemplo, clone RMK-45).
3. Validação da especificidade do CAR
   1. Estimule as células do hibridoma transduzido com antígenos celulares ou ligados a placas apropriados. Após co-cultura durante a noite, colete sobrenadantes e citocinas secretadas e analisado por ensaio imunoenzimático (ELISA).
      NOTA: Idealmente, cada CAR deve ser validado independentemente antes de ser usado para transdução. Nesta etapa, o experimento pode ser pausado e reiniciado posteriormente.

2. Transfecção de células produtoras virais (dia - 4 ao dia 3)

NOTA: O retrovírus é produzido usando células Phoenix-ECO (consulte a Tabela de Materiais). Use as precauções apropriadas para a geração de agentes potencialmente infecciosos (de preferência incluindo um gabinete designado de nível de biossegurança 2 (BSL-2) e incubadora separada para cultura de células transfectadas / transduzidas).

1. Descongelamento de células da Fênix (Dia -4)
   1. Descongele 2 x 10⁶ células Phoenix-Eco. Aumente o número de células Phoenix se várias transduções forem planejadas.
   2. Coloque-os em uma placa de cultura de tecidos de 10 cm com 10 mL de meio (meio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) contendo 10% de soro fetal de bezerro (FCS)).
2. Células da Fênix de Passagem (Dia -3)
   1. Remova o meio e lave com 5 mL de solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS).
   2. Adicione 3 mL de tripsina a 0,25% e incube a 37 ° C sob atmosfera de CO_{10% 2} por 3 min.
   3. Colha as células e depois granule por centrifugação por 3 min a 200 x g. Recoloque as células em placas com 10 ml de meio fresco e incube a 37 °C.
3. Irradiação de células Phoenix (Dia -1 tarde)
   1. Para minimizar a divisão celular adicional, colete células Phoenix conforme descrito na etapa 2.2, ressuspenda em 5 mL de meio e irradie células gama em gelo (1000 rad).
      NOTA: Deve-se ter cuidado com o trabalho de radiação para evitar a exposição do pessoal.
   2. Centrifugue as células irradiadas, ressuspenda em meio fresco, coloque em placa a 2 x 10⁶ células (em 10 mL de meio) / placa / CAR e incuba.
4. Transfecção (Dia 0 - manhã)
   1. Aspire o sobrenadante das células Phoenix, lave com 5 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) e adicione cuidadosamente 7 mL de meio sérico reduzido (por exemplo, Opti-MEM) gota a gota na parede lateral da placa para evitar perturbar a monocamada. Transfira as células de volta para a incubadora.
   2. Pegue dois tubos de polipropileno de fundo redondo de 14 mL e adicione 1,5 mL de meio sérico reduzido a cada um. A um tubo, adicione 40 μL de reagente de transfecção (consulte a Tabela de Materiais).
   3. Ao outro tubo, adicione 15 μg de plasmídeo Ab-CAR (gerado na etapa 1) e 5 μg de plasmídeo de envelope e embalagem (5 μg pCL-Eco). Incube os tubos em temperatura ambiente por 5 min.
   4. Adicione a mistura de reagentes de transfecção da etapa 2.4.2 gota a gota ao segundo tubo sem entrar em contato com as laterais do tubo e misture pipetando a solução para cima e para baixo suavemente 3 vezes. Incube em temperatura ambiente por pelo menos 20 min.
   5. Adicione 3 mL da mistura gota a gota às células Phoenix e coloque em uma incubadora de cultura de tecidos.
   6. Após 4–5 h, adicione 1 mL de FCS. Cultura de células durante a noite a 37 °C.
5. Variação média (Dia 1)
   1. Remover o sobrenadante que contém os complexos de plasmídeos/reagentes de transfecção e eliminá-los de acordo com os procedimentos institucionais de manuseamento de material infeccioso. Adicione 4 mL de meio de cultura fresco e pré-aquecido às células.
6. Vírus da colheita para transdução (dia 2)
   1. Colete o meio contendo vírus das células Phoenix com uma seringa estéril, filtre (0,45 μm) para remover os detritos celulares residuais e colete em um novo tubo.
   2. Adicione o estoque de interleucina-2 humana recombinante (rhIL-2) a uma concentração final de 200 unidades internacionais (UI) / mL. Use o vírus imediatamente para transdução (etapa 5.3). Adicione 4 mL de meio fresco às células Phoenix e coloque na incubadora.
7. Repetir a coleta de vírus (Dia 3)
   1. Repita a etapa 2.6, mas descarte as células Phoenix como resíduos infecciosos em vez de adicionar meio fresco. Este sobrenadante é usado na etapa 5.4.

3. Isolamento e ativação de células T CD8 primárias (dia -1 ao dia 0)

NOTA: Anteriormente, colete células T CD8 de camundongos diabéticos não obesos (NOD) em 4 a 5 semanas, um ponto de tempo antes do início da inflamação das ilhotas. Manuseie todos os camundongos seguindo os protocolos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC). As células T CD8 são enriquecidas a partir de esplenócitos usando um kit comercial de seleção negativa.

1. Placas de revestimento com anticorpos CD3/CD28 (Dia -1)
   1. Adicione 1 ml de uma mistura de anticorpos CD3 e CD28 de ratinho (ambos a 1 μg/ml em PBS) a cada alvéolo de uma placa de 24 poços e incube a 4 °C durante a noite.
   2. No dia seguinte, lave as placas com 1 mL de PBS estéril 3 vezes antes de adicionar as células T CD8 murinas (passo 4.1).
      NOTA: O número de poços a serem revestidos varia para cada experimento, dependendo do número total de células T CD8 ativadas necessárias.
2. Coleta de esplenócitos (Dia 0)
   1. Eutanasiar dois camundongos fêmeas NOD com idade entre 4 e 5 semanas usando inalação de CO₂ seguida de decapitação. Colha os baços e coloque-os em uma peneira de células embebida em 10 mL de PBS em uma placa de cultura de células no gelo.
   2. Em uma capa de cultura de células, corte cada baço em 3-5 pedaços, pressione os tecidos com um êmbolo estéril de uma seringa de 3 ou 5 mL para separar os fragmentos do baço e permitir que as células passem pela tela de arame.
   3. Remova suavemente os glóbulos vermelhos ressuspendendo os esplenócitos em tampão de lise de glóbulos vermelhos diluído 1:4 (1 mL de tampão de lise em 3 mL de PBS para um baço) e incubando por 5 min em temperatura ambiente.
   4. Em seguida, diluir 10 μL da suspensão celular com solução de corante azul de tripano para contagem de células com um hemocitômetro e granular o restante das células por centrifugação a 350 x g por 7 min.
3. Enriquecimento de células T CD8 (Dia 0)
   1. Enriqueça as células T CD8 por seleção negativa usando um kit de isolamento de células T CD8 de camundongo, seguindo as instruções do fabricante.
      NOTA: Para garantir uma elevada pureza, arredonde sempre o número de células ao calcular o volume de anticorpo biotinilado a adicionar (por exemplo, utilize o volume de reagentes sugerido para 10⁸ células para um cálculo de 9,1 x 10⁷ células).
   2. Suspenda os grânulos celulares em 400 μL de tampão e 100 μL de coquetel de biotina-anticorpo por 1 x 10⁸ células, misture bem e incube por 5 min na geladeira (4 ° C) para permitir a ligação do anticorpo.
   3. Adicione 300 μL de tampão de marcação e 200 μL de microesferas anti-biotina por 1 x 10⁸ células, misture bem e incube por 10 min a 4 ° C.
   4. Enquanto aguarda a ligação do micro-esfera, coloque a coluna de separação no separador. Lave a coluna enxaguando com 3 mL de tampão de rotulagem.
   5. Passe 1000 μL de mistura de grânulos/células através de um filtro de células de 40 μm antes de carregar na coluna de separação para remover os agregados celulares. Recolha o fluxo da coluna para um tubo pré-resfriado de 15 mL.
   6. Lave a coluna conforme as instruções do fabricante, coletando todo o efluente no mesmo tubo. Determine o número de células (o mesmo que o passo 3.2.4) e colete por centrifugação a 350 x g por 5 min. Lave as células ressuspendendo em 2 mL de meio de células T completo (RPMI-1640 contendo FCS, 2-mercaptoetanol, rhIL-2 (200 U / mL), Interleucina-7 de camundongo (mIL-7, 0,5 ng / mL), ITS, ácido 4-(2-hidroxietil) -1-piperazineetanossulfônico (HEPES) e penicilina-estreptomicina) e centrifugando a 350 x g por 5 min.
   7. Ressuspenda as células em meio de células T completo pré-aquecido (37 ° C) a uma concentração de 0,25–0,5 x 10⁶ / mL.

4. Ativação de células T (Dia 0 a 2)

1. Adicione 2 mL da suspensão celular (0,25–0,5 x 10⁶/mL) a cada poço revestido da placa de 24 poços revestida com anticorpo CD3/CD28 da etapa 3.1.2. Use um movimento giratório para dispensar as células uniformemente.
   NOTA: Adicione as células usando um movimento de turbilhão para distribuí-las uniformemente e minimizar os efeitos de borda. Se as células se agruparem ao longo da borda dos poços, tanto a taxa de transdução quanto a viabilidade celular serão diminuídas.
2. Como controle, coloque o mesmo número de células T CD8 em um único poço não revestido da placa. Incubar as células a 37 °C usando uma incubadora com gás de CO_{10% 2} por 48 h.
   NOTA: Após 48 h, a ativação pode ser confirmada usando um microscópio; as células ativadas serão maiores do que as células que não encontraram anticorpos anti-CD3/CD28.

5. Transdução de células T CD8 ativadas (dias 1 a 3)

NOTA: Este protocolo usa um método de transdução de spin. É necessária uma centrífuga com rotor basculante e adaptadores de placa de cultura de tecidos capazes de manter uma temperatura interna de 37 °C. Para garantir a máxima eficiência, no dia da transdução, pré-aqueça a centrífuga a 37 °C antes de coletar o vírus.

1. Preparação de placas revestidas com fragmentos de fibronectina humana (dia 1 ao dia 2)
   1. No dia 1, adicione 0,5 mL de fibronectina (50 μg / mL em PBS) aos poços de uma placa de 24 poços e incube durante a noite a 4 ° C.
      NOTA: Normalmente, são necessários dois poços revestidos com fibronectina por placa de células Phoenix transfectadas.
   2. No dia 2, remova a solução de fibronectina e substitua por 1 mL de albumina de soro bovino (BSA) a 2% em PBS. Incube em temperatura ambiente por 30 min para "bloquear" locais de ligação não específicos.
   3. Lave os poços tratados com 1 mL de PBS estéril. Após remover a solução de lavagem, a placa está pronta para uso; ou podem ser selados e armazenados a 4 °C por até uma semana.
2. Coleta de células T CD8 ativadas (Dia 2)
   1. Colha as células T CD8 ativadas, conte e calcule a viabilidade celular usando azul de tripano ou um instrumento automatizado adequado.
   2. Colete as células por centrifugação e ressuspenda a 5 x 10⁶ células viáveis / mL para transdução. Manter uma pequena alíquota de células em cultura no meio completo de células T na incubadora de CO₂ para fornecer um controle para a classificação subsequente de células ativadas por fluorescência das células transduzidas (etapa 6).
      NOTA: Após a ativação por 48 h, o número total de células deve ter aumentado aproximadamente 1,5 vezes e ter uma viabilidade superior a 95%.
3. Transdução (Dia 2)
   1. Adicione 100 μL de suspensão de células CD8 ativadas por poço (0,5 x 10⁶ células) à placa revestida com fibronectina. Em seguida, adicione 1,5–2 mL de meio contendo vírus (da etapa 2.6) a cada poço. Misture usando um movimento giratório para dispensar as células uniformemente (Figura 2).
   2. Coloque a placa em um saco plástico zip-lock e feche (para fornecer contenção secundária). Centrifugar a 2000 x g durante 90 min a 37 °C.
   3. Remova a placa da centrífuga. Na segurança biológica, o gabinete remove cuidadosamente o saco plástico e garante que a parte externa da placa não esteja contaminada com nenhum meio.
   4. Em seguida, transfira a placa para a incubadora dedicada de CO₃₇ °C 2. Após 4 h, remova 1 mL do meio de cada poço e substitua por 1 mL de meio de células T completas pré-aquecido. Recoloque a placa na incubadora de CO₂.
      NOTA: Manuseie todos os meios das células transduzidas como resíduos infecciosos.

Resultados

Figura 1: Esquema do construto retroviral do CAR. O CAR compreende um domínio de direcionamento derivado do fragmento Fab de um anticorpo monoclonal de camundongo adequado e um domínio espaçador / âncora de membrana / sinalização de CD28, CD137 e CD247 de camundongo. O cDNA sintético é inserido no vetor de expressão retroviral pMIG-II. Os locais de endonuclease de restrição usados para gerar o mAb287...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
2-Mercaptoetanol (50mM)	Gibco	Rolamento 21985-023	50 uM
5' PCR DA RAÇA	Clontech	634859
anticorpos anti-CD28 em camundongos	eBiociência	14-0281-86	Concentração final a 1μg/ml
anticorpo CD3e de camundongo	eBiociência	145-2C11	Concentração final a 1μg/ml
Biotina Rato Anti-Rato IFN-γ	BD Biociências	Rolamento 554410	Concentração de trabalho a 0,5 μg/ml
Bsa	sigma	Rolamento A7030
Kit Maxi-Prep sem endodômen	Qiagen	Rolamento 12362
gentamicina	Gibco	15750-060	50 μg/ml final.
FCS inativado por calor	Hyclone	SH30087.03	Final 10% FCS
HEPES (100X)	Gibco	Rolamento 15630-080	1X
Insulina-Transferrina-Selênio-Etanolamina (ITS 100x)	ThermoFisher	51500056	A concentração final é 1x
Lipofectamina 2000	Invitrogen	11668019
Colunas LS	Miltenyi Biotec	130-042-401
Buffer de separação MACS	Miltenyi Biotec	130-091-221
Kit de isolamento de células T CD8a + de camundongo	Miletenyi Biotec Inc	130-104-075
Kit de isolamento de células T CD8a + de camundongo	Miltenyi Biotec	130-104-075
Meio Opti-MEM	ThermoFisher	31985070
Penicilina-estreptomicina (5000U/ml)	ThermoFisher	15070063	50 U/ml
Células Phoenix-ECO	ATCC	CRL-3214
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)	Gibco	10010-023
pMIG II	Addgene	Rolamento 52107
pMSCV-IRES-GFP II	Addgene	Rolamento 52107
Tampão de lise de glóbulos vermelhos	sigma	R7767
Retronectina	Takara	T100A	Concentração de trabalho a 50 μg/ml em PBS
rhIL-2 (concentração de estoque 105 UI/ul)	Peprotech	200-02	Concentração final a 200 UI/ml
rmIL-7 (concentração de estoque 50ng/ul)	R&d	407-ML-005	Concentração final a 0,5 ng/ml
RPMI-1640	Gibco	11875-093
Filtros de células estéreis	Fisher Científico	22-363-548
Triplo	Gibco	Rolamento 12605-028