1. Microinjeção de embriões de peixe-zebra com bactérias e coquetel de fagos
NOTA: Para realizar uma infecção sistêmica, o embrião deve ter circulação sanguínea que geralmente começa após 26 hpf.
- Após 26 hpf, descorionar embriões com solução de pronase preparada dissolvendo o pó de pronase em meio E3 na concentração de 2 mg/mL. Pipete suavemente os embriões para quebrar o córion. Descarte o meio pronase/E3 e enxágue o prato várias vezes com E3 fresco para remover todo o pronase.
- Anestesiar embriões de peixe-zebra em meio E3 contendo Tricaine aproximadamente 5 min antes das injeções.
- Pipetar os embriões anestesiados para o trajeto preparado no passo 1. Use uma ponta de carregamento de gel fino para forrar os embriões na posição lateral.
- Carregue uma agulha de microinjeção com aproximadamente 5 μL da preparação de P. aeruginosa.
- Insira a agulha dorsalmente até o ponto inicial do ducto de Cuvier, onde começa a se espalhar sobre o saco vitelino. Injete um volume de 1-3 nL e certifique-se de que o volume se expande diretamente dentro do duto e entra na circulação.
- Aproximadamente após cada 50 embriões injetados, injetar uma gota da bactéria em um tubo de centrífuga de 1,5 mL com 100 μL de PBS estéril para verificar se o volume de injeção permanece o mesmo. Colocar o inóculo em ágar LB (ver quadro 1) a 37 °C durante a noite para avaliar o UFC.
- Transferir os embriões microinjectados para duas placas de Petri limpas com meio E3 fresco + PTU (quadro 1) e incubá-los a 28 °C.
- Em dois momentos selecionados: 30 min ou 3 h após a injeção bacteriana, retire uma das placas de Petri com embriões injetados por bactérias da incubadora e alinhe-as no trajeto conforme descrito em 6.3 para a injeção do coquetel de fagos.
- Carregue uma agulha de microinjeção com aproximadamente 5 μL do coquetel de fagos (mistura de quatro fagos que infectam a cepa PAO1) com uma ponta de carregamento de gel fino e fixe-a no microinjetor.
- Injete o coquetel de fagos no ducto de Cuvier dos embriões previamente injetados com bactérias.
- Transferir os embriões microinjectados para duas placas de Petri limpas com meio E3 fresco + PTU e incubá-los a 28 °C.
Tabela 1: Preparação das soluções
| Soluções | preparação |
| Solução de estoque anestésico 25X | 4 mg/mL de Tricaína em H2O destilado. |
| Solução de trabalho anestésico 1X | diluir em H2O destilado a solução estoque de tricaína 25X preparação para atingir a concentração 1X (0,16 mg/mL) de tricaína de H2O destilado. |
| CsCl d=1,3 | 20,49 g em 50 mL TN |
| CsCl d=1,4 | 20,28 g em 50 mL TN |
| CsCl d=1,5 | 34,13 g em 50 mL TN |
| CsCl d=1,6 | 41,2 g em 50 mL de NT |
| Meio embrionário E3 para embrião de peixe-zebra | 1 L 1 de E3 (diluir o estoque 50X com H2O destilado) + 200 μl de azul de metila a 0,05% . Armazene na RT. |
| E3 solução de estoque de meio embrionário (50X) | 73,0 g de NaCl, 3,15 g de KCl, 9,15 g de CaCl2 e 9,95 g de MgSO4 em 5 L de H2O destilado. Armazene na RT. |
| ágar LB | 10 g/L de triptona, 5 g/L de extracto de levedura, 5 g/L de NaCl, 10 g/L de ágar |
| LB caldo | para 1L: 950 mL de H2O, 10 g de triptona, 10 g de NaCl, 5 g de extrato de levedura |
| PBST | PBS 1X + Triton X 1% |
| Solução fisiológica | 0,9% NaCl |
| Solução de estoque de bloqueio de pigmentação 10X | 0,3 mg/mL de feniltioureia (PTU) em pó em meio embrionário E3 para embrião de peixe-zebra |
| Solução de estoque Pronase 5X | 5 mg/mL de pronase em pó em meio embrionário E3 para embrião de peixe-zebra |
| Amortecedor TN | 10 mM Tris HCl pH 8,0, 150 mM NaCl |
