Uma injeção de plasma rico em plaquetas no tendão de Aquiles seccionado de um rato

Resumo

Fonte: Greimers, L., et al. Efeitos do Plasma Rico em Plaquetas Alogénico (PRP) no Processo de Cicatrização de Tendões de Aquiles Seccionados de Ratos: Uma Descrição Metodológica. J. Vis. Exp. (2018).

Este vídeo demonstra uma técnica para injetar plasma rico em plaquetas (PRP) no tendão de Aquiles seccionado de ratos. Um pequeno segmento é excisado do tendão de Aquiles de um rato receptor, o local é suturado e o rato pode se recuperar. Ao mesmo tempo, o sangue total é coletado de um rato doador e centrifugado para obter o PRP, que é então ativado e injetado no local suturado do rato receptor para induzir o reparo do tendão.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Preparação Animal

1. Utilizar 132 ratos Sprague-Dawley machos de 2 meses, com um peso de 320-450 g (120 ratos para experimentação e 12 ratos para colheita de sangue, figura 1). Quinze ratos para cada grupo foram suficientes para um poder de 0,8 (80% de chance de encontrar significância estatística se o efeito especificado existir).
2. Alojar todos os ratos em gaiolas clássicas em condições de isolamento em uma instalação convencional equipada com um trocador. Instigar a reprodução em um rack IVC (gaiola ventilada individualmente), com ratos SPF (livres de patógenos específicos) sendo comprados especificamente.
3. Use as seguintes condições de alojamento: faixa de temperatura de 19-24 °C; umidade relativa: 40-60%; ventilação: frequência de renovação do ar: 10-15 por h; ciclo claro/escuro: 12 h-12 h.
4. Esterilize todos os equipamentos de gaiola e use roupas de cama irradiadas. Implemente sistematicamente o enriquecimento da gaiola, colocando bandejas de papelão estéreis e toalhas dentro das gaiolas.
5. Permita o acesso à zona em condições restritas: jaleco novo, máscara, luvas, calçados e touca na entrada.
6. Realizar anualmente o monitoramento da saúde das colônias em animais sentinelas alojados em camas sujas, de acordo com as recomendações da Felasa para instalações convencionais. Manter quatro a cinco animais por gaiola com a dieta irradiada adequada e fornecer água acidificada ad libitum. Monitore diariamente.
7. Transfira ratos eleitos para intervenção cirúrgica na filtragem de gaiolas superiores para as salas cirúrgicas 2 h antes da cirurgia.

2. Procedimento Cirúrgico

1. Prepare os instrumentos cirúrgicos: tesoura fina, pinça, duas pinças hemostáticas e porta-agulhas. Durante todos os procedimentos, use luvas, máscara, capuz e jaleco.
2. Divida aleatoriamente os ratos em dois grupos (PRP e solução salina).
3. Tire o rato da gaiola e pese-o. Use brincos numerados para identificar os ratos. Para evitar a dessecação dos olhos, coloque gotas de água na córnea.
4. Anestesiar o rato por via intraperitoneal com xilazina (10 mg/kg de peso corporal) e cetamina (80 mg/kg de peso corporal). Colocar os animais sob monitorização cardiorrespiratória para confirmar a anestesia e verificar os reflexos oculares.
5. Injete 50 μL de buprenorfina por via subcutânea (0,01-0,05 mg / kg a cada 8-12 h) na área do pescoço como analgésico.
6. Raspe o membro posterior esquerdo com um barbeador elétrico, desinfete-o com 3 esfregões alternados de solução de isobetadina/álcool (diluído 1:10) e coloque o rato em uma almofada quente (20 ° C) sob um microscópio de dissecação. Coloque o rato em decúbito lateral com a perna a ser operada em posição superior. Segure a pata com pinças cirúrgicas.
7. Com a tesoura, faça uma pequena incisão lateral (20-25 mm) na pele ao redor do tendão de Aquiles esquerdo e disseque a fáscia com uma tesoura fina para expor o complexo do tendão de Aquiles (Figura 2a).
8. Remova o tendão plantar com uma tesoura (Figura 2b).
9. Corte o tendão de Aquiles transversalmente 5 mm proximal à sua inserção no calcâneo e remova uma porção de 5 mm de comprimento com uma tesoura. Não suturar o tendão (Figura 2c, 2d).
10. Suturar a fáscia e a pele com fio reabsorvível, fazendo uma sutura overjet (sutura contínua). As suturas de monofilamento também podem evitar a absorção da pele para a incisão cirúrgica.
11. Coloque o rato sob uma lâmpada de aquecimento até acordar e, em seguida, coloque-o de volta em uma gaiola (58 x 38 cm) (Nota bene: Nenhuma imobilização é imposta).

3. Preparação do PRP

1. Anestesiar os ratos doadores com xilazina (10 mg/kg de peso corporal) e cetamina (80 mg/kg de peso corporal) por injeção intraperitoneal. A injeção de PRP é realizada 2 h após a cirurgia sem qualquer reanestesia.
2. Injete 50 μL de buprenorfina por via subcutânea como analgésico.
3. Colete sangue total (20 mL por rato, sangramento final) por punção cardíaca em tubos estéreis contendo citrato de sódio tamponado a 3,2% (0,109 M, anticoagulante). Em seguida, eutanasiar o rato por injeção intracardíaca.
4. Para obter o PRP, centrifugue o sangue por 10 min a 150 x g e temperatura ambiente. Essa etapa inicial de centrifugação de baixa velocidade produz duas fases distintas: uma fase inferior composta por glóbulos vermelhos (hemácias) que representa cerca de 80-90% do volume total e uma fase superior composta por plasma rico em plaquetas (PRP) (normalmente 10-20% da amostra de sangue).
5. Colete o PRP (fase superior) em um tubo de plástico secundário usando uma pipeta de transferência de plástico. Como a interface entre o PRP e os glóbulos vermelhos é muito frouxa, não pipete muito perto da interface. Quando manuseadas adequadamente, as hemácias contaminantes no PRP devem estar abaixo de 0,05 x 10³ células/μL. Descarte a fase inferior restante e o tubo primário de coleta de sangue.
6. Determine o volume de PRP coletado e meça a contagem de plaquetas em um analisador hematológico. Esses valores são necessários para cálculos para ajustar a concentração de plaquetas na próxima etapa. Uma contagem de células sanguíneas também é útil para avaliar a contaminação potencial com hemácias e leucócitos. A concentração de plaquetas no PRP neste estágio é tipicamente de 1 a 1,5 x10⁶ / μL.
7. Realize uma segunda centrifugação do PRP por 10 min a 1.000 x g e temperatura ambiente. Esta etapa de centrifugação de alta velocidade produz um pellet de plaquetas soltas e um sobrenadante de plasma autólogo pobre em plaquetas (PPP). Usando os valores determinados na etapa 3.6, calcule o volume de sobrenadante a ser descartado para concentrar o PRP e atingir uma concentração final de 2,5 x10⁶ / μL.
8. Recolha cuidadosamente o sobrenadante (PPP) num tubo de plástico secundário utilizando uma pipeta de transferência de plástico, deixando cerca de dois terços do volume final calculado no passo 3.7. Como o pellet está solto, uma quantidade significativa de plaquetas é perdida quando o PPP é descartado, reduzindo potencialmente a concentração desejada.
9. Ressuspenda cuidadosamente o sedimento de plaquetas com o sobrenadante restante por pipetagem suave e repetida. Meça a contagem de plaquetas neste PRP concentrado. Se necessário, adicione o volume apropriado de PPP autólogo para atingir a concentração final desejada.
   nota: Use o PRP dentro de 3 h após a preparação.
10. Adicione 50 μL de CaCl₂ (11 mEq 10 mL) por mL de PRP para ativar as plaquetas.
11. Injete 50 μL de PRP fresco ou solução salina com uma agulha 21G diretamente no local da operação suturada cerca de 1 h após a preparação. Durante esse período, mantenha o PRP em temperatura ambiente.
12. Monitore de perto a recuperação funcional dos ratos durante os dias após a cirurgia e antes da remoção do tendão de Aquiles.

Resultados

Figura 1: Desenho experimental do estudo.

Figura 2: Procedimento cirúrgico.

(a) O complexo tendinoso após a remoção da fáscia circundante.

(b) Remoção do tendão plantar.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Xilazina (Xyl-M)	Vmd	nenhum	anestésico
Cetamina (Jétamine 1000 CEVA)	CEVA Santé Animale	nenhum	anestésico
Buprenorfina (Multidose Veterinária)	ALSTOE	nenhum	analgésico
iso-betadina	MEDA-Pharma	nenhum	Desinfetante
Fio reabsorvível Vicryl 6/0	Johnson & Johnson
Nembutal	CEVA Santé Animale	nenhum	anestésico
Paraformaldeído	Sigma-Aldrich	Pág. 6148	Preserva a estrutura do tecido
Isopropanol 100%	VWR	2,09,22,364
Etanol 95%	VWR	2,08,23,362
xileno	VWR	Rolamento 28973.363
parafina	VWR	LEIC3950.1006
Hematoxilina	Millipore	Rolamento 1.15938.0025	Corante
Eosina	Millipore	1.15935.0100	Corante
Eukitt	Sigma-Aldrich	3989	Meio de montagem
CaCl2