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1. Síntese de polímero poli(beta amino ésteres) (pBAE) com oligopeptídeos finais (OM-pBAE)
- Polimerização de C6-pBAE
- Adicione 5-amino-1-pentanol (38 mmol; MW = 103,16 Da) 1-hexilamina (38 mmol; MW = 101,19 Da) em um frasco de vidro de fundo redondo (100 mL). Em seguida, adicione diacrilato de 1,4-butanodiol (82 mmol; MW = 198,22 Da).
- Pré-aqueça o banho de óleo de silicone a 90 °C, coloque o balão de fundo redondo no banho de óleo e agite a mistura com o auxílio de uma barra de agitação magnética durante a noite (~18 h). Em seguida, retirar o produto do balão de fundo redondo e colocá-lo no congelador a -20 °C.
nota: O produto está na forma de um pó pegajoso e é retirado do frasco com o auxílio de uma espátula. É essencial validar a estrutura do polímero obtido através de 1H-RMN. Os espectros de RMN foram registrados em um instrumento de 400 MHz (ver Tabela de Materiais) usando clorofórmio-d e D2O como solventes. Cerca de 10 mg de cada éster poli(β-amino) foram tomados e dissolvidos em 1 mL do solvente deuterado.
- Reação com peptídeos para obtenção de OM-pBAE
- Adicione 25 mL de HCl 0,1 M a peptídeos selecionados, por exemplo, peptídeo Cys-His-His-His com ácido trifluoroacético (TFA, 200 mg), em um tubo de centrífuga de 50 mL previamente pesado que pode suportar a liofilização e mexer manualmente durante a noite para obter uma solução clara.
- Congelar a solução a -80 °C durante 1 h e liofilizar o cloridrato peptídico resultante.
NOTA: Verifique se o peso final corresponde ao valor teórico.
- Fazer uma solução de C6-pBAE (0,031 mmol) em dimetilsulfóxido. Além disso, faça uma solução do cloridrato de peptídeo (0,078 mmol) em dimetilsulfóxido.
- Misture as duas soluções em um tubo com tampa de rosca e aperte a tampa. Agitar a solução da mistura em banho-maria com temperatura controlada de 25 °C durante 20 h com uma barra de agitação magnética.
- Adicione a mistura a éter dietílico / acetona 7: 3 (v / v). Centrifugar a suspensão resultante a 25.000 x g a 4 °C para remover o solvente. Em seguida, lave o sólido com éter dietílico / acetona 7: 3 (v / v) duas vezes. Em seguida, seque o produto sob vácuo (<0,2 atm).
- Fazer uma solução de 100 mg/ml do produto em dimetilsulfóxido. O produto resultante é denominado C6-peptídeo-pBAE. É essencial validar a estrutura do polímero obtido através de 1H-RMN para confirmar o desaparecimento dos sinais de olefina associados aos acrilatos terminais. Se não for usado, o polímero pode ser congelado a -20 °C.
2. Formação de poliplexos
NOTA: Todos os procedimentos devem ser realizados dentro de uma sala condicionada para manter uma temperatura constante.
- Descongele os polímeros C6-peptídeo-pBAE e vortex a solução.
- Pipetar a mistura de polímeros para cima e para baixo e preparar uma solução de 12,5 mM (V1) em acetato de sódio (NaAc). Em seguida, vortex a mistura e aguarde 10 min.
- Preparar o ácido ribonucleico mensageiro (ARNm) a 0,5 mg/ml e misturar pipetando (V2).
nota: É crucial evitar o vórtice do mRNA.
- Vortex a mistura de polímeros na concentração final para obter uma solução homogênea entre o estoque de polímero em dimetilsulfóxido (DMSO) e o tampão acetato.
nota: A concentração final do polímero depende da relação N/P (grupos nitrogênio para fosfato) selecionada. A relação N/P depende de cada mRNA específico a ser usado. Para encapsulamento aprimorado de proteína fluorescente verde (eGFP), por exemplo, foi usada uma proporção de 25:1, conforme relatado anteriormente.
- Misture a solução de material genético e a solução de C6-peptidepBAE (25x da concentração de mRNA) na proporção de 1:1 (Vi = V1 + V2).
nota: O peptídeo C6-pBAE é carregado em um tubo de microcentrífuga onde o mRNA é adicionado pipetando para cima e para baixo para mistura. Uma vez preparadas, as concentrações de poliplex, ácido nucléico e peptídeo C6-pBAE são diluídas pela metade.
- Incubar a 25 °C durante 30 min num bloco térmico. Precipitar com água livre de RNase 1:2 adicionando a amostra a um tubo de microcentrífuga pré-carregado com água.
- Inclua os excipientes. Adicione o mesmo volume que a mistura de mRNA e pBAE (Vi) em ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfônico (HEPES) 20 mM e sacarose 4% pipetando para cima e para baixo. Neste ponto, a amostra foi diluída 3x.
3. Liofilização de poliplexos
- Congelar instantaneamente a -80 °C da solução poliplex anterior durante 1 h.
- Realize a secagem primária seguindo os passos: (1) 1 h a -60 °C e 0.001 hPa; (2) 1 h a -40 °C e 0,0001 hPa; (3) 4 h a -20 °C e 0,0001 hPa; (4) 12 h a 5 °C e 0,0001 hPa.
- Conservar imediatamente a -20 °C para evitar a reidratação até à utilização.