1. Expressão do núcleo de nanopartículas de proteína auto-montável contendo uma proteína de feixe de seis hélices (SHB-SAPN) em E. coli BL21(DE3)
- Misture 95 mL do componente A e 5 mL do componente B do meio em um frasco Erlenmeyer de vidro estéril de 2 L de acordo com as instruções do fabricante (consulte a Tabela de Materiais). Adicione ampicilina a uma concentração final de 100 μg / mL.
- Inocule o meio com E. coli de uma cultura de estoque de glicerol previamente estabelecida. Incubar a cultura a 30 °C com agitação a 200 rotações por minuto (rpm) por 48 h.
NOTA: O estoque de E. coli BL21 (DE3) usado continha o vetor de expressão resistente à ampicilina com o gene SHB-SAPN. Embora o protocolo geral do meio recomende 24 h de incubação a 37 °C, 48 h de incubação a 30 °C proporcionam maior rendimento para SHB-SAPN.
- Transfira a cultura para dois tubos cônicos de 50 mL. Centrifugue os tubos a 4.000 x g por 10 min com um rotor de ângulo fixo a 4 °C. Remova o sobrenadante e guarde o pellet para colher células.
NOTA: O pellet celular pode ser processado imediatamente ou congelado a -80 °C até o uso.
2. Lise de E. coli BL21(DE3) por sonicação
NOTA: Use material plástico não pirogênico e material de vidro cozido a 250 °C por pelo menos 30 min. Tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP), como agente redutor, quebra as ligações dissulfeto dentro e entre as proteínas. O TCEP é necessário para os tampões durante este protocolo se o antígeno exibido contiver ligações SS. Somente para o núcleo SHB-SAPN, a presença de TCEP nos buffers não é essencial.
- Prepare tampão sem imidazol (8 M de ureia, 50 mM de fosfato de sódio monobásico, 20 mM de base Tris, 5 mM de TCEP) pH 8,0 (ajustado com 5 N de hidróxido de sódio, NaOH) e filtre-o usando uma unidade de filtração de garrafa de vácuo de 0,22 μm.
- Ressuspenda as células peletizadas (da etapa 1.3) com 40 mL de tampão livre de imidazol em um tubo cônico de 50 mL. Sonicar as células ressuspensas com uma sonda no gelo por 5 min (4 s de sonicação, 6 s de repouso) com uma saída de sonicação de 150 W.
- Centrifugue o lisado celular (40 mL) a 29.000 x g a 4 ° C por 25 min em um rotor de ângulo fixo para gerar sobrenadante clarificado. Transferir o sobrenadante para um balão estéril de 150 ml e rejeitar o sedimento. Diluir o sobrenadante para 100 mL usando o tampão isento de imidazol (posteriormente no protocolo referido como "amostra").
NOTA: Esta etapa de diluição é necessária para evitar que a pressão do sistema de cromatografia líquida de desempenho rápido (FPLC) se torne muito alta durante o carregamento do lisado na coluna.
3. Purificação de proteínas usando uma coluna His
NOTA: Este protocolo foi realizado usando um instrumento FPLC, mas pode ser adaptado ao fluxo por gravidade.
- Preparar os seguintes tampões e filtrá-los utilizando uma unidade de filtração em garrafa de vácuo de 0,22 μm: i) Tampão sem imidazol "Tampão A" (ureia 8 M, fosfato de sódio monobásico 50 mM, base Tris 20 mM, TCEP 5 mM) pH 8,0; (ii) tampão imidazol 500 mM "Tampão B" (8 M Ureia, 50 mM fosfato de sódio monobásico, 20 mM Tris base, 5 mM TCEP, 500 mM Imidazol) pH 8,0; e (iii) lavagem com isopropanol (20 mM Tris, 60% de isopropanol) pH 8,0.
NOTA: O pH para cada tampão foi ajustado com NaOH 5 N.
- Equilibre a coluna His.
NOTA: Para produção em escala de laboratório, este protocolo usa uma coluna His pré-embalada de 5 mL, mas qualquer coluna de tamanho maior pode ser usada.
- Abra o software FPLC e clique na opção Novo método. Ele será aberto imediatamente no menu de configurações do método. No menu suspenso para a posição da coluna, escolha a porta C1 3.
- No menu suspenso Mostrado por técnica, escolha afinidade. No menu suspenso Tipo de coluna, escolha outros, Histrap HP, 5 mL. O volume da coluna e as caixas de pressão serão ajustados automaticamente para os valores apropriados.
- Clique no botão Contorno do método. Arraste os seguintes botões do menu pop-up da biblioteca de fases: equilíbrio, aplicativo de amostra, lavagem de coluna e eluição ao lado da seta nessa ordem exata. Feche o menu Biblioteca de fases.
- Clique no botão de equilíbrio. Os valores listados na tabela devem ser "buffer inicial B" (4%), "buffer final B" (4%) e "volume (CV)" 5.
- Clique na caixa Exemplo de aplicativo. Na caixa de carregamento de amostra, clique no botão de opção para Injetar amostra na coluna com bomba de amostra. Certifique-se de que a caixa ao lado das configurações Usar taxa de fluxo do método esteja marcada no sample injeção com bomba do sistema. Ao lado da caixa de volume no lado direito da tela, altere o valor para 20 mL.
- Clique no botão Lavagem de colunas. Os valores listados na tabela devem ser "buffer inicial B" (4%), "buffer final B" (4%) e "volume (CV)" 5. Ao lado do esquema de coleta de frações, desmarque a caixa Habilitar.
- Clique no botão de eluição. Os valores listados na tabela devem ser "buffer inicial B" 0%, "buffer final B" 100% e "volume (CV)" 5. Ao lado do esquema de coleta de frações, clique na caixa Ativar. Desmarque as configurações Usar tamanho da fração do método e ajuste o tamanho da fração para 4 mL na caixa de preenchimento abaixo.
- Clique no botão salvar como na parte superior do software. Nomeie o arquivo como "equilíbrio".
- Conecte uma coluna His pré-embalada de 5 mL à porta de coluna 3 correspondente no FPLC. Tanto a tubulação da bomba A quanto a da bomba B, bem como a tubulação da bomba de amostra, devem ser colocadas em água deionizada filtrada de 0,22 μm. Execute o programa de equilíbrio.
- Coloque a bomba A e a bomba B, bem como a tubulação da bomba de amostra, no tampão sem imidazol (tampão A) e execute o protocolo de equilíbrio novamente.
- Ligar a amostra à coluna e purificar a proteína.
- Abra o software FPLC e clique na opção Novo método. Ele será aberto imediatamente no menu de configurações do método. No menu suspenso de Coluna, escolha a porta C1 3. No menu suspenso Mostrado por técnica, escolha afinidade. No menu suspenso do tipo de coluna, escolha outros, Histrap HP, 5 mL. O volume da coluna e as caixas de pressão serão automaticamente ajustados para os valores apropriados.
- Clique no botão Contorno do método. Arraste os botões do menu pop-up da biblioteca de fases: equilíbrio, aplicativo de amostra, lavagem de coluna (Lavagem 1), lavagem de coluna (Lavagem 2), lavagem de coluna (Lavagem 3) e Eluição ao lado da seta nessa ordem exata. Feche o menu Biblioteca de fases.
- Clique no botão Equilíbrio. Os valores listados na tabela devem ser "buffer inicial B" 4%, "buffer final B" 4% e "volume (CV)" 5.
- Clique na caixa Exemplo de aplicativo. Na caixa de carregamento de amostra, clique no botão de opção para aamostra I nject na coluna com a bomba de amostra. Certifique-se de que a caixa ao lado das configurações Usar vazão do método esteja marcada na caixa sample injeção com a bomba do sistema.
- Ao lado da caixa de volume no lado direito da tela, altere o valor para 100 mL. Ao lado do esquema de coleta de frações, clique no botão Ativar. Desmarque a caixa Usar tamanho da fração nas configurações do método e altere o tamanho da fração para 4 mL.
- Clique no botão de lavagem da primeira coluna (Lavagem 1). Os valores listados na tabela devem ser "buffer inicial B" 4%, "buffer final B" 4% e "volume (CV)" 10. Ao lado do esquema de coleta de frações, clique na caixa Habilitar. Desmarque a opção Usar tamanho da fração nas configurações do método e altere o tamanho da fração para 4 mL.
- Clique no botão de lavagem da segunda coluna (Lavagem 2). Os valores listados na tabela devem ser "buffer inicial B" 0%, "buffer final B" 0% e "volume (CV)" 5. Ao lado do esquema de coleta de frações, clique na caixa Habilitar. Desmarque a opção Usar tamanho da fração nas configurações do método e altere o tamanho da fração para 4 mL.
- Clique no botão de lavagem da terceira coluna (Lavagem 3). Os valores listados na tabela devem ser "buffer inicial B" 0%, "buffer final B" 0% e "volume (CV)" 5. Ao lado do esquema de coleta de frações, clique em Ativar. Desmarque a caixa Usar tamanho da fração nas configurações do método e altere o tamanho da fração para 4 mL.
- Clique no botão Eluição. Na tabela à direita, clique nas informações listadas e, no menu que aparece, clique na etapa Excluir. Arraste o botão de gradiente isocrático para a tabela duas vezes para que haja duas entradas.
- O valor da primeira entrada deve ser "buffer inicial B" 30%, "buffer final B" 30% e "Volume (CV)" 10. O valor da segunda entrada deve ser "buffer inicial B" 100%, "buffer final B" 100% e "volume (CV)" 10. Ao lado do esquema de coleta de frações, clique no botão Ativar. Clique na caixa ao lado de Usar tamanho da fração nas configurações do método.
- Clique no botão Salvar na parte superior do software. Nomeie o arquivo como "purificação". A tubulação da bomba A do FPLC deve ser colocada no tampão de lavagem sem imidazol, enquanto a tubulação da bomba B deve ser colocada no tampão imidazol de 500 mM. A tubulação da bomba de amostra deve ser colocada na amostra de 100 mL.
- Execute o programa de "purificação" e aguarde o momento em que o isopropanol a 60% é necessário (Lavagem 2). Pause o programa; mova a bomba A da lavagem sem imidazol para a lavagem com isopropanol a 60%. Reinicie o programa.
- Assim que a etapa de isopropanol estiver concluída, pause o programa novamente e mova para bombear o tubo A de volta para o tampão de lavagem sem imidazol. Reinicie o programa de purificação (o resto da execução é automatizado).
