Construindo um modelo de camundongo humanizado com imunidade projetada contra o HIV

Abstract

Fonte: Zhen, A., et al. Imunidade projetada baseada em células-tronco contra a infecção pelo HIV no modelo de camundongo humanizado. J. Vis. Exp. (2016).

O vídeo demonstra uma técnica para gerar um modelo de camundongo humanizado com imunidade projetada baseada em células-tronco contra o vírus da imunodeficiência humana (HIV). O tecido do timo fetal humano e as células-tronco hematopoiéticas (HSCs) projetadas são implantados na cápsula renal de um camundongo gravemente imunocomprometido. As HSCs, que expressam receptores de antígenos quiméricos (CARs) contra o HIV, são misturadas em uma mistura de proteínas gelatinosas que promove sua co-localização com o tecido timo. Após o procedimento, as HSCs se diferenciam em várias células imunológicas humanas, resultando no desenvolvimento de um modelo de camundongo humanizado com um sistema imunológico humano funcional contra o HIV.

Protocol

Todos os procedimentos que envolvem a coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto. Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Construção de camundongos humanizados projetados com receptor de antígeno quimérico CD4

1. Processamento do timo fetal e isolamento de HSCs CD34+ do fígado fetal
   1. Processamento de timo
      1. Lave suavemente o timo em solução salina tamponada com fosfato (PBS), pH 7,4, em um tubo cônico de 15 ml. Repita a etapa de lavagem 3 a 4 vezes.
      2. Adicione 7 ml de meio do Roswell Park Memorial Institute (RPMI) + 10% de soro fetal bovino (FBS) + penicilina/estreptomicina (Pen/estreptococos). Transvase tudo para uma placa de Petri estéril de 100 mm.
      3. Use bisturis para cortar o timo em pequenos pedaços de cerca de 1 mm². Coloque cada pedaço de timo em um único poço em uma placa de 96 poços. Use uma pinça curva sem corte ao transferir pedaços de timo para a placa de 96 poços.
         1. Adicione uma pequena quantidade de meio (100 - 200 μl) a todos os poços para que o tecido não seque. Visualize ao microscópio (os timos têm lóbulos e devem se parecer com sacos de células).
            nota: Descarte todas as peças que pareçam questionáveis de alguma forma; Muitas vezes há tecido conjuntivo, e este não deve ser implantado.
      4. Retirar os pedaços de timo confirmados e colocá-los todos num balão de cultura de células T25. Adicione 7 ml de meio RPMI suplementado com 10% de FBS e 450 μg/ml de piperacilina/tazobactam e anfotericina B. Agite suavemente o frasco para misturar. Cultivar o balão durante a noite a 37 ºC/5% CO₂,
         nota: Esta etapa é necessária para evitar a contaminação bacteriana do tecido.
      5. (Etapa opcional) Congele o timo para uso futuro. Equilibre os pedaços em 90% de soro AB humano com 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) por 10 min. Congele-os a 1 ºC/min a -50 ºC e, em seguida, resfrie rapidamente a -150 ºC. Quando estiver pronto para descongelar, descongele rapidamente em banho-maria a 37 ºC e lave suavemente 3x em meio RPMI completo sem DMSO.
   2. Processamento de fígado
      1. Lave suavemente o fígado em PBS em um tubo cônico de 50 ml. Repita a etapa de lavagem 3 a 4 vezes.
      2. Adicione 10 ml de Iscove's Modified Dulbecco's Media (IMDM) ao tubo cônico de 50 ml. Transvase tudo para uma placa de Petri estéril de 100 mm.
      3. Homogeneizar o tecido hepático com dois bisturis. Corte o fígado em pequenos pedaços de cerca de 3 mm². Corte e descarte qualquer tecido conjuntivo branco.
      4. Use uma seringa de 10 ml equipada com uma agulha romba de calibre 16 para pegar os pedaços de fígado e o meio. Em seguida, transfira para um tubo cônico de 50 ml.
      5. Ressuspenda a suspensão média e tecidual e expulse mais 5-7 vezes para homogeneizar completamente o tecido.
      6. Prepare 10 ml de meio IMDM suplementado com enzimas: 500 U / ml de colagenase, 2.400 U / ml de hialuronidase e 300 U / ml de DNase, bem como 450 μg / ml de piperacilina / tazobactam e anfotericina B. Filtre o meio com um filtro de 0,22 μm e adicione o meio à suspensão hepática.
      7. Tampe o tubo cônico de 50 ml contendo a suspensão hepática e feche bem com uma película autovedante, como Parafilm, para evitar vazamentos. Girar em um rotador de tubo na incubadora a 37 ºC por 90 min.
      8. Filtrar a suspensão celular digerida através de um filtro de células de 100 μm para um tubo fresco de 50 ml.
         nota: Adicionar PBS à suspensão para aumentar o volume total para 50 ml. Divida-o em dois tubos de 50 ml, cada um contendo 25 ml de suspensão celular.
      9. Lenta e suavemente subjaz as células em cada tubo com 10 ml de meio de centrifugação de densidade (por exemplo, Ficoll). Gire a 1.200 x g por 20 min sem freio. Nota: toda a centrifugação mencionada neste protocolo é feita à temperatura ambiente (25 ºC).
      10. Remova cuidadosamente a interface (ou seja, buffy coat) de cada tubo e transfira para dois tubos separados de 50 ml. Aumente o volume de cada tubo de interface até 50 ml com PBS. Gire a 300 x g por 7 - 10 min. Aspirar o sobrenadante cuidadosamente.
      11. Combine os dois pellets. Lave mais três vezes com 50 ml de PBS contendo 2% de FBS. Gire a 300 x g por 7 a 10 minutos cada, aspirando cuidadosamente o sobrenadante.
      12. Ressuspenda o pellet em 50 ml de mídia RPMI + 10% FBS. Conte as células usando um hemocitômetro antes de prosseguir com a classificação das células.
      13. De acordo com o protocolo do fabricante, classifique as células CD34+ imediatamente usando um kit de classificação CD34 (por exemplo, microesferas CD34).
          nota: Alternativamente, as células podem ser cultivadas durante a noite em meio RPMI + 10% FBS a 1 milhão / ml.
      14. Salve as frações CD34+ e CD34-.
          nota: Nesta etapa, as células CD34+ e CD34- podem ser congeladas usando meios de congelamento Bambanker ou outros meios de congelamento. Congele 1 ml de 4 - 6 x 10⁶ células CD34 + por tubo e congele 1 ml de 40 - 60 x 10⁶ células CD34- por tubo.
2. Transdução de células CD34+
   1. Calcule o número de poços de transdução necessários para uma placa de cultura de tecidos de 6 poços. Um poço pode ser usado para transduzir até 8 x 10⁶ células. Para cada camundongo medula óssea/fígado/timo (BLT), 0,5 x 10⁶ células CD34+ serão implantadas junto com células CD34- e timo sob a cápsula renal, e 0,5 x 10⁶ células CD34+ serão injetadas por via intravenosa. O número de células CD34+ a serem usadas é determinado pelo número de camundongos (1 milhão de células por camundongo).
   2. Cubra o número necessário de poços de placa de 6 poços não tratados com cultura de tecidos com 1,25 ml de solução de fibronectina humana recombinante (por exemplo, retronectina) (20 μg / ml em PBS) em cada poço. Cubra a placa e deixe-a repousar por 2 horas em temperatura ambiente em um gabinete de biossegurança limpo.
   3. Aspire a solução de fibronectina dos poços e adicione 1,25 ml de tampão de classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) (PBS com 4% de FBS) a cada poço para bloqueio. Deixe a placa repousar em temperatura ambiente (25 ºC) por 30 min.
   4. Aspire o FACS Buffer e lave os poços uma vez com PBS.
   5. Mantenha o PBS nos poços revestidos até que a placa esteja pronta para uso. Conservar a placa a 4 ºC durante a noite, se não for utilizada imediatamente.
   6. Colocar células CD34+ em meio de infecção (albumina sérica humana a 2% no meio de células T sem soro de Yssel) em poços revestidos com solução de fibronectina (~2 x 10,6 células/ml) e incubar a 37 ºC por 1 hora.
   7. Use uma pipeta para adicionar vetores lentivirais aos poços em uma multiplicidade de infecção (MOI) entre 2 - 10. Misture delicadamente e incube durante a noite a 37 ºC.
      nota: O título do vetor lentivírus usado deve ser determinado previamente.
   8. Colha as células no dia seguinte, raspando suavemente o fundo dos poços com um raspador de células. Colete as células e conte com um hemocitômetro.
   9. Para preparar as células para o implante, combine 0,5 x 10⁶ células CD34 + transduzidas com 4,5 x 10⁶ células CD34- por camundongo, alíquota em tubos estéreis de 1,5 ml com tampa de rosca. Gire as células para baixo a 300 x g para o pellet e aspire o sobrenadante. Gire-os novamente a 300 x g, aspire o sobrenadante restante com uma pipeta P10 e aspire com muito cuidado. Mantenha os pellets secos no gelo durante todo o estudo. nota: Para garantir que as células sejam viáveis, use as células peletizadas e realize a cirurgia dentro de 2-3 horas.
   10. Para preparar as células para injeção, gire 0,5 x 10⁶ células CD34 + transduzidas por camundongo para pellet e aspirar sobrenadante. Ressuspenda as células em meio RPMI de 100 μl por camundongo e mantenha no gelo.
   11. Para verificar a eficiência da transdução, alíquota ~1 x 10⁵ células CD34+ não transduzidas e transduzidas de cada condição e cultura em meio de citocinas de 200 μl (meio RPMI com 10% de FBS, suplementado com 100 ng/ml de IL-3 humana, IL-6, SCF) em placa de 96 poços por 5 a 7 dias a 37 ºC.
       nota: As células usadas nesta etapa não são usadas para cirurgia, mas para garantir que a transdução seja bem-sucedida e o vetor não seja tóxico para a sobrevivência e renovação das células-tronco. A eficiência da transdução pode ser verificada procurando a expressão gênica do vetor (por exemplo, GFP e CD4) e analisada por citometria de fluxo.
3. Transplantes de tecidos para construir camundongos geneticamente modificados
   1. No mesmo dia antes da cirurgia, é realizada a irradiação corporal total do NOD. Camundongos imunocomprometidos Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) com um irradiador de césio-137 e uma dosagem de 2,7 Gy (270Rad).
      nota: Os camundongos NSG são gravemente imunocomprometidos. Portanto, seu alojamento e manutenção devem estar em conformidade com os mais altos padrões de saúde e ser tratados por uma equipe altamente treinada.
   2. Despeje os pedaços de timo e o meio do frasco em um prato de 60 mm. Despeje o PBS em outro prato de 60 mm, que será usado para limpar o trochar e manter o rim úmido.
   3. Resfrie as pontas da pipeta de deslocamento positivo colocando-as em tubos abertos com tampa de rosca estéril de 1,5 ml no gelo. Mantenha no gelo com os pellets de células secas e a mistura de proteínas gelatinosas, como Matrigel.
      nota: É importante manter a mistura de proteínas gelatinosas e quaisquer tubos ou pontas que a toquem fria até que a agulha do implante seja carregada.
   4. Anestesie os ratos: Pese os ratos individualmente e registre os pesos; dê um soco na orelha dos ratos para numerá-los. Injete-os por via intraperitoneal com 15 μl de cetamina (2,6 mg / ml em solução salina) / xilazina (100 mg / ml em solução salina) por grama de peso corporal). Coloque os ratos de volta na gaiola e espere que estejam totalmente anestesiados.
      nota: Verifique o nível de anestesia do mouse apertando uma pata. Se o camundongo recuar reflexivamente, administre 25-50% da quantidade original de cetamina / xilazina para anestesiar ainda mais o camundongo. Espere até que ele não vacile reflexivamente para realizar a cirurgia.
   5. Usando o cortador Oster (barbeador), raspe o lado esquerdo de cada mouse do quadril ao ombro entre o centro das costas e o estômago. Injete por via subcutânea 0,3 ml de Carprofeno diluído (6 mg/kg) no ombro ou triângulo inguinal do animal (perna). Usando um cotonete, coloque uma pequena gota de lágrimas artificiais em cada olho e coloque o mouse de lado de volta na gaiola.
      nota: Limite a preparação da cirurgia a uma gaiola (aproximadamente 4 a 5 camundongos) por vez.
   6. Lave a cânula da agulha do implante de câncer de calibre 16 (trocarte) com PBS. Usando uma pinça curva romba, coloque um pedaço de timo do prato de 60 mm na abertura da cânula com o trocarte dentro da abertura e, em seguida, puxe o trocarte para aspirar o tecido para dentro da cânula.
   7. Use uma pipeta de deslocamento positivo e uma ponta gelada para colocar 5 μl de mistura de proteína gelatinosa fria no tubo com um pellet de células secas (mistura CD34 + e CD34- para células implantadas) e mexa suavemente para gerar a suspensão celular. Não pipete para cima e para baixo. Pipete a mistura de proteínas gelatinosas/suspensão celular na abertura da cânula e puxe lentamente o trocarte para carregar a agulha.
      nota: Recomenda-se ter um ajudante para carregar a pipeta enquanto se manipula a agulha do implante.
   8. Limpe a área raspada do camundongo com iodopovidona e, em seguida, limpe a área com um lenço umedecido com álcool três vezes. Determine o ponto mais escuro sob a pele. Isso indica a localização do baço. O rim é aproximadamente 5 mm dorsal ao baço. Levante a pele com pinça curva e faça uma incisão de 15 mm de comprimento com tesoura cirúrgica na pele paralela ao baço. Em seguida, faça um corte semelhante na camada de peritônio abaixo. Nos homens, o rim deve ser facilmente visível e pode ser extrudado simplesmente pressionando o abdômen. Você pode apoiar o rim com um hemostático ou uma pinça curva romba. Nas mulheres, os ovários tendem a bloquear o rim de fácil extração. Usando um hemostático, pegue o ovário e exponha cuidadosamente o rim.
   9. Use a pinça com ponta de agulha para fazer um pequeno orifício na extremidade posterior da cápsula renal.
      nota: Não use essas pinças com ponta de agulha para manusear materiais de risco biológico.
   10. Deslize a agulha do implante neste orifício e ao longo do rim até que a abertura da cânula esteja completamente coberta pela cápsula renal.
   11. Expulse suavemente o tecido sob a cápsula renal e puxe a agulha de volta para fora. Os pedaços de timo podem ser pegajosos, então use uma pinça curva para garantir que o pedaço de timo não saia com a agulha.
   12. Levante o peritônio com a pinça e use suavemente o hemostático para empurrar o rim de volta ao lugar. Amarre um ponto de nó duplo no peritônio usando pontos absorvíveis de vicryl 4-0. Use dois clipes de ferida Autoclips para fechar a pele.
   13. Misture as células CD34+ transduzidas reservadas para injeção e absorva 100 μl (0,5x10⁶ células) em uma seringa de insulina. Injete essas células no camundongo por meio de injeção de veia retroorbital ou outras vias de injeção intravenosa. Usando um cotonete, coloque uma pequena gota de lágrimas artificiais em cada olho e coloque o rato de lado em uma gaiola.
   14. Depois que todos os camundongos forem implantados, confirme se os animais estão recuperando a consciência e deambulando normalmente antes de deixá-los.
   15. Cuidados pós-operatórios: Injetar subcutaneamente 0,3 ml de Carprofeno diluído (6 mg/kg) e 1,2 ml de solução salina estéril em cada camundongo no dia seguinte à cirurgia. 2 e 3 dias após a cirurgia, injetar subcutaneamente 1,5 ml de solução salina estéril em cada camundongo. Monitore os camundongos e as incisões por 10 a 14 dias após a cirurgia. Remova os Autoclips e pese os mouses após 10-14 dias. nota: Os camundongos ficam lentos após a radiação, e a injeção de solução salina evita que os animais desidratem.
   16. Após 8 a 10 semanas, verifique o enxerto sangrando os camundongos e realizando a análise FACS no sangue periférico, colorindo marcadores como CD45, CD3, CD4, CD8 e quaisquer genes que o vetor deva expressar.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kit de microesferas CD34	Miltenyi	130-046-702	Para classificar células progenitoras CD34+ humanas
Bambanker	Wako	302-14681	para congelamento de células
Kit de RNA viral QIAamp	Qiagen	Rolamento 52904	Para medir a carga viral no soro
Citômetro de fluxo MACSQuant	Miltenyi		Para análise de fluxo
BD LSRFortessa™	BD biociências		Para análise de fluxo
Hialuronidase	sigma	H6254-500MG	Para digestão de tecidos
Desoxirribonuclease I	Worthington	LS002006	para digestão de tecidos
Colagenase	Tecnologia da vida	17104-019	para digestão de tecidos
Sistema de detecção de PCR em tempo real CFX	Biorad		Para medir a carga viral e a expressão gênica
Camundongos, cepa NOD. Cg-Prkdcscid IL2RGTM1Wjl/SZJ	O Laboratório Jackson	Rolamento 5557	Para construir os ratos humanizados
Penicilina estreptomicina (estreptococos em caneta)	Thermo Fisher Científico	10378016	Para cultura de células
piperacilina/tazobactam	Pfizer	Zosyn	Antifúngico
Anfotericina B (Fungizone antimicótico)	Thermo Fisher Científico	15290-018	Antifúngico
AUTOCLIP Clips Clips de Enrolar, 9 mm - 1000 unidades	Becton Dickinson	427631	Para cirurgia
Batas cirúrgicas estéreis reforçadas com polietileno Aurora, 30 por caixa	Medline	DYNJP2707	Para cirurgia
Suturas, 4-0, vicryl	Owens e Menor	23000J304H	Para cirurgia
Almofadas de preparação de álcool	Owens e Menor	3583006818	Para cirurgia
Luvas cirúrgicas 6 1/2	Owens e Menor	4075711102	Para cirurgia
Meio de células T sem soro de Yssel	Gêmeos Bioprodutos	400-102	Para transdução de células CD34+
Albumina sérica humana	Sigma-Aldrich	A9511	Para transdução de células CD34+