Geração de vesículas da membrana plasmática a partir de células-tronco da medula óssea

Abstract

Fonte: Xu, L. et al., Preparação de Vesículas de Membrana Plasmática a partir de Células-Tronco Mesenquimais da Medula Óssea para Potencial Terapia de Reposição de Citoplasma.J. Vis. Exp. (2017)

Este vídeo demonstra um método para gerar vesículas de membrana plasmática a partir de células-tronco da medula óssea, passando-as rapidamente por um filtro de membrana. Esses PMVs mostram potencial para terapia de reposição citoplasmática.

Protocol

1. Montagem do aparelho

1. Para garantir a esterilidade, ligue a luz ultravioleta (UV) de uma capa de cultura de tecidos por 30 minutos antes de usar.
2. Desaparafuse uma unidade de filtro descartável de 25 mm e mergulhe a tampa e o fundo da unidade em um copo de vidro de 200 mL cheio de etanol a 75% por 30 min. A unidade é feita de polipropileno de grau médico.
3. Pegue a tampa e a parte inferior da unidade usando uma pinça, sacuda o etanol restante com a mão e deixe as peças secarem ao ar por 10 min no capô.
4. Umedeça uma membrana de policarbonato de 19 mm em solução salina tamponada com fosfato (PBS) e coloque-a cuidadosamente em cima da matriz de suporte da parte inferior da unidade. O filme de polímero tem uma superfície lisa e plana e poros de 3 μm gravados em trilha.
5. Remonte a unidade aparafusando a tampa firmemente contra a parte inferior. Certifique-se de que a membrana não esteja desalojada do centro.
6. Remova a agulha de uma seringa de insulina de 1 mL e retire 1 mL de PBS. Conecte a seringa à unidade de filtro e, em seguida, empurre o PBS através da unidade para molhar o conjunto e testar se há algum vazamento.

2. Geração de Vesículas da Membrana Plasmática (PMVs)

1. Estabelecer uma cultura de células-tronco mesenquimais da medula óssea (BMSC), conforme relatado por Nemeth et al., no meio de cultura Modified Eagle Medium (DMEM) de Dulbecco contendo 15% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina/estreptomicina. Cultive as células em uma placa de 6 poços em uma incubadora umidificada contendo 5% de CO₂ a 37 ° C.
2. Para propagar as células, remova o meio de cultura e enxágue o poço com 0,5 mL de PBS sem cálcio.
3. Adicione 0,5 mL de ácido tetracético tripsina-etilenodiamina a 0,25% (tripsina-EDTA) e incube as células a 37 ° C por 3 min. Bata a placa contra a palma da mão algumas vezes para facilitar o descolamento celular. Pare a digestão adicionando 1 mL de meio de cultura.
4. Colete as células em um tubo cônico de 15 mL e gire a 200 x g por 2 min em uma centrífuga de bancada. Ressuspenda as células em 4 mL de meio de cultura e alíquota as células em dois poços de uma placa de 6 poços.
   nota: As células geralmente atingem a confluência por volta de 24 h.
5. Para gerar PMVs, colha as células de um poço (cerca de 5 x 10⁵ células) de uma placa de 6 poços por digestão de tripsina e monodisperse as células em 0,5 mL de meio de cultura.
6. Carregue as células na seringa de insulina, conecte-a à unidade de filtro e empurre o êmbolo rapidamente para espremer as células através do filtro. Descarte o meio extrudado porque deve haver apenas alguns PMVs dentro dele.
7. Coloque mais 0,5 mL de meio na seringa e empurre-o rapidamente através do filtro. Coletou o meio da segunda extrusão, que contém PMVs de vários tamanhos.
8. Carregue 150 μL do meio coletado em um prato com fundo de vidro de 35 mm e deixe os PMVs assentarem no fundo por cerca de 10 min. Examine os PMVs sob um microscópio de contraste de fase invertida equipado com uma câmera CCD usando a lente objetiva 20X.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Membranas IsoporeTM	Millipore	TSTP04700	Poro de 3 mm
Unidade de filtro descartável	Xinya, Xangai, China	25 milímetros	Polipropileno de grau médico
Seringa de insulina	Bd	328446	1 ml