Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Mutagênese UV para gerar cepas de levedura auxotrófica
- Gerar curvas de sobrevivência para determinar as doses necessárias de irradiação ultravioleta (UV)
- Prepare o meio YPD (extrato de levedura, peptona, dextrose) e outros reagentes listados na Tabela 1 de acordo com os procedimentos padrão e inocule colônias únicas em 5-10 ml de meio YPD. Incubar as culturas num tambor de rolos a 30 °C O/N até à saturação durante, pelo menos, 8 horas.
- Determinar a concentração celular das culturas durante a noite (O/N) utilizando um espectrofotómetro diluindo as células a 1:10 em água numa cubeta de plástico. Diluir as células até uma concentração de 107 células/ml em 20 ml de água destilada estéril.
- Despeje as células diluídas em uma placa de Petri de plástico estéril e, com a tampa removida, coloque a placa 14 cm abaixo de uma lâmpada UV.
- Expor as células a doses seriadas de 5.000 μJ e 10.000 μJ de irradiação UV, extraindo 500 μl de células após cada incremento, de modo que as células sejam amostradas após exposição a 0 μJ, 5.000 μJ, 10.000 μJ, 15.000 μJ, 20.000 μJ, 25.000 μJ, 30.000 μJ, 40.000 μJ, e 50.000 μJ de irradiação UV. Transfira as amostras de células extraídas para tubos estéreis de 1,5 ml e dilua em série em incrementos de 1:10 em água estéril.
- Células de pellets em cada diluição por centrifugação em uma microcentrífuga a 16.000 x g por 1 min. Aspirar o sobrenadante e ressuspender em um volume de 100 μl de água estéril apropriada para o revestimento de células de levedura. Pipete todo o volume de células ressuspensas em placas contendo meio sólido YPD e use um espalhador estéril para distribuir as células uniformemente em cada placa.
- Envolva as bordas da placa em Parafilm para evitar o ressecamento da mídia e as placas de cobertura em folha de alumínio para evitar a fotorreativação e o reparo de mutações induzidas por UV. Incube as placas de cabeça para baixo a 30 °C por 2-4 dias para permitir o crescimento de colônias de leveduras viáveis (Figura 1).
- Conte o número de colônias, opcionalmente com a ajuda de uma caneta para marcar as colônias contadas, uma caneta de contador eletrônico portátil ou um suporte de contador com ampliação. Plotar como uma porcentagem do total de células plaqueadas em cada dose μJ de irradiação UV para gerar uma curva de sobrevivência para leveduras irradiadas (Figura 2).
NOTA: Pode-se esperar que as cepas de levedura haplóides exijam doses mais baixas de irradiação UV em relação às cepas diplóides para atingir a mesma porcentagem de sobrevivência. Uma cepa de levedura sem enzimas funcionais de reparo de DNA, como o mutante rad1 S. cerevisiae, pode ser usada como controle positivo para indicar a presença de irradiação UV em doses muito baixas.
- Determinar a dose de mutagénese UV a utilizar para o rastreio, referindo-se à curva de sobrevivência estabelecida no ponto 1.1.7. O valor x do ponto ao longo da curva de sobrevivência onde y é igual a 50 é a dose de irradiação UV na qual 50% da levedura sobrevive. A triagem de mutantes com essa baixa porcentagem de sobrevivência pode resultar em um maior rendimento de cepas mutadas com sucesso, particularmente para leveduras diplóides. A dose de sobrevida de 50% para WT S. boulardii, conforme mostrado na Figura 2, é de aproximadamente 18.000 μJ.
NOTA: Embora essas altas doses de UV aumentem o risco de mutações em genes para outras vias celulares além do gene marcador auxotrófico de interesse, essa desvantagem deve ser equilibrada com a necessidade de induzir mutações em ambas as cópias do gene marcador auxotrófico. Para cepas haplóides nas quais apenas uma cópia do gene deve ser mutada, a triagem com uma porcentagem de sobrevivência mais alta, como 90%, diminui o risco de mutações adicionais e ainda permite a geração suficiente de mutantes auxotróficos.
- Mutagênese UV e triagem para cepas de leveduras auxotróficas
- Prepare o fermento conforme descrito nas etapas 1.1.1-1.1.3.
- Expor a levedura à dose de irradiação UV correspondente a 50% de sobrevivência, conforme determinado em 1.1.8. Para WT S. boulardii, essa dose foi determinada em aproximadamente 18.000 μJ (Figura 2).
- Coletar volumes de 1 ml de levedura irradiada por UV e pellet por centrifugação em uma microcentrífuga a 16.000 x g por 1 min. Aspirar sobrenadante e ressuspender as células em 100 μl de água estéril.
- Seleção de mutantes
- Se estiver usando seleção, como com mutantes auxotróficos ura3-, aplique levedura irradiada em um meio contendo ácido 5-fluoroorótico (5-FOA) para selecionar células sem uma enzima Ura3 funcional.
NOTA: Qualquer levedura contendo cópias funcionais de Ura3 converterá 5-FOA na toxina 5-fluorouracil, levando à morte celular e permitindo a fácil seleção de colônias de ura3 que não possuem um Ura3 funcional. Abordagens de seleção análogas são possíveis para o LYS2 e LYS5; TRP1;e marcadores MET2 e MET15 usando meios contendo ácido α-aminoadípico; ácido 5-fluoroantranílico; e metilmercúrio, respectivamente.
- Pipete os 100 μl de células ressuspensas em um meio mínimo contendo 5-FOA e use um espalhador estéril para revestir uniformemente a placa. Embrulhe as placas em Parafilm e incube de cabeça para baixo a 30 ° C por 2-4 dias para permitir o crescimento de colônias de leveduras viáveis.
- Confirme o fenótipo ura3- de qualquer colônia que apareça em placas 5-FOA recorrendo às placas YPD, uracila e 5-FOA (Figura 3). Use a ponta de um palito estéril para coletar parte de uma única colônia e arraste suavemente as células através de placas frescas de YPD, uracila e 5-FOA. Novamente, incube as placas embrulhadas de cabeça para baixo a 30 °C por 2-4 dias.
NOTA: As colônias viáveis aparecerão como crescimentos elevados e aproximadamente circulares, enquanto as células não viáveis aparecerão apenas como um esfregaço opaco sem nenhum crescimento elevado (Figura 3).
- Rastreio de mutantes
- Se gerar um mutante auxotrófico para o qual os métodos de seleção não estão disponíveis, prepare diluições seriais 1:10 de células de levedura irradiadas por UV em água estéril e pipete as diluições em meio YPD, usando um espalhador estéril para revestir uniformemente a placa.
- Embrulhe as placas em Parafilm e incube de cabeça para baixo a 30 °C por 2-4 dias. Determine qual diluição permitiu o crescimento de colônias individuais que podem ser facilmente distinguidas umas das outras, geralmente não mais do que aproximadamente 100 colônias por placa.
- Repetir a mutagénese UV das amostras de levedura conforme descrito nos pontos 1.2.1-1.2.3 e das células em placa, nesta diluição determinada. Pipete a levedura diluída em meio YPD, use um espalhador estéril para distribuir as células e incube as placas embrulhadas de cabeça para baixo a 30 ° C por 2-4 dias.
- Rastreie os auxotróficos por meio de réplicas em meios seletivos sem o metabólito de interesse. Primeiro, prenda uma almofada de veludo estéril em um suporte de prato e inverta o prato com colônias irradiadas por UV no veludo, marcando a orientação do prato.
- Em seguida, inverta uma placa nova sem o metabólito de interesse no veludo e pressione levemente para transferir as células do veludo para a placa. Armazene a placa original a 4 °C. Embrulhe e incube a nova placa de cabeça para baixo a 30 °C por 2-4 dias.
- Como alternativa ao revestimento de réplicas, rastreie os mutantes re-listrando colônias de YPD em meios seletivos. Use a ponta de um palito estéril para coletar parte de uma única colônia e arraste suavemente as células através de uma placa YPD fresca e uma placa sem o metabólito de interesse. Incube novamente as placas embrulhadas de cabeça para baixo a 30 °C por 2-4 dias.
NOTA: Deve-se tomar cuidado para selecionar colônias únicas e riscar as colônias várias vezes para confirmar uma população homogênea de células auxotróficas verdadeiras.
- Confirme ainda o fenótipo das células irradiadas inoculando colônias únicas em 5-10 ml de YPD e meio sem o metabólito apropriado (por exemplo, em meio de uracila para um mutante ura3). Incubar em um tambor de rolos a 30 °C O/N para confirmar o crescimento de células em meio YPD, mas não na ausência do metabólito.
NOTA: Embora os padrões de crescimento em meios sólidos devam indicar claramente o status auxotrófico da levedura, é possível que algumas leveduras tolerem tensões e formem colônias pequenas e de crescimento lento em meios sólidos, mas ainda não tolerem as mesmas condições em meios líquidos (observações não publicadas). A inoculação em culturas líquidas deve, portanto, ser realizada para confirmar completamente os padrões de crescimento de mutantes irradiados por UV.
- Para armazenamento a longo prazo de mutantes auxotróficos confirmados, preparar estoques de glicerol inoculando células em 10 ml YPD e incubando em um tambor de rolo O/N a 30 °C. Células de pellets por centrifugação por 3 min a 2.500 x g e meio aspirado. Ressuspenda as células em glicerol filtrado estéril a 50%, transfira para um criopar e armazene a -80 °C.
NOTA: A levedura mutagênica UV potencialmente contém mutações em vários genes além do marcador auxotrófico de interesse. Antes de continuar com o uso de mutantes auxotróficos verificados, essas cepas devem ser analisadas por meio de sequenciamento genético e avaliação da resistência ao pH, estresses de ácidos biliares e outras características relevantes para cepas probióticas, conforme descrito em outro lugar2. Além disso, o uso de homologia de pcr ou direcionamento CRISPR/Cas9 para mutar marcadores auxotróficos de forma mais seletiva deve ser considerado como uma alternativa à mutagênese UV.
2. Transformação de levedura
- Transformação LiOAc de levedura
- Inocular colónias de leveduras individuais em 5-10 ml de meio YPD e incubar num tambor de rolos a 30 °C O/N.
- Para induzir o crescimento da fase logarítmica e aumentar a eficiência da captação do plasmídeo, determine a concentração celular usando um espectrofotômetro para medir uma diluição de 1:10 das células em água estéril em uma cubeta de plástico. Diluir as culturas O/N até obter uma densidade óptica a 600 nm (OD600) de 0,16-0,2 (aproximadamente 2 x 106- 2,5 x 106 células/ml) em 50 ml de YPD quente e fresco e incubar as células num agitador de plataforma orbital regulado para 200 rpm até que a cultura atinja aproximadamente 1 x 107 células/ml, geralmente em torno de 4 hr.
NOTA: A eficiência de transformação pode ser medida em função do número de unidades formadoras de colônias de leveduras transformadas com sucesso (UFC) por μg de DNA de plasmídeo. O aumento da eficiência resulta em mais colônias transformadas por μg de DNA de plasmídeo. A subcultura de células de levedura e a coleta durante o crescimento da fase logarítmica é um fator que aumenta a eficiência da transformação.
- Células de pellets por centrifugação a 2.500 x g por 3 min.
- Aspirar o sobrenadante e transferir as células para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, ressuspendendo o sedimento em 1 ml de água estéril.
- Células de pellets por centrifugação a 16.000 x g por 1 min em uma microcentrífuga, aspirar o sobrenadante e lavar as células por ressuspensão em 1 ml de tampão TE / LiOAc (Tris EDTA / acetato de lítio).
- Repita a centrifugação e ressuspenda as células em tampão TE/LiOAc até uma concentração de 2 x 109 células/ml.
- Preparar misturas de transformação com cada um dos seguintes elementos: 50 μl de levedura preparada em tampão TE/LiOAc, 5 μl de ADN transportador (10 μg/μl) e 1 μl de ADN plasmidial (1 μg). Microgramas de DNA plasmidial podem ser titulados, pois quantidades crescentes de DNA podem ou não levar a uma maior eficiência de transformação.
NOTA: Para uma cepa de levedura mutante sem um marcador auxotrófico, apenas um plasmídeo que codifica o marcador pode ser transformado por amostra. Além disso, o uso de um plasmídeo que codifica uma proteína facilmente detectável, como a proteína fluorescente verde (GFP), permitirá a determinação eficiente do dobramento adequado e da expressão de proteína heteróloga pela cepa de levedura após a transformação.
- A cada preparação, adicionar 300 μl de PEG/LiOAc/TE e vórtice abundantemente. A incubação de células intactas com polietilenoglicol (PEG) é essencial para uma transformação eficiente.
- Incubar as preparações a 30 °C durante 30 minutos com agitação, colocando tubos de microcentrífuga num copo colocado sobre um agitador de plataforma orbital a 200 rpm.
- Adicionar 35 μl de dimetilsulfóxido (DMSO) a cada reação e aquecer as células de choque durante 15 minutos num banho-maria a 42 °C. Embora existam relatos conflitantes sobre o benefício adicional do DMSO, o choque térmico de células de levedura intactas demonstrou aumentar muito a eficiência da transformação.
- Lavar as células por peletização por centrifugação, como indicado no ponto 2.1.5, aspirando ou pipetando o sobrenadante e ressuspendendo em 1 ml de água estéril. Pipete suavemente para cima e para baixo para quebrar o pellet celular.
NOTA: É fundamental remover completamente o sobrenadante porque o meio usado na geração de células competentes pode inibir o crescimento de leveduras e a formação de colônias.
- Repetir a peletização celular como em 2.1.5, aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em 100 μl de água estéril. Pipete todo o volume em uma placa seletiva e use um espalhador estéril para revestir uniformemente a placa com fermento transformado.
- Enrole as bordas das placas revestidas em Parafilm para evitar a secagem do meio e incube de cabeça para baixo a 30 °C por 2 dias para permitir o crescimento de células de levedura transformadas. A transformação bem-sucedida e eficiente e a seleção auxotrófica de Saccharomyces cerevisiae produzem um alto número de colônias por preparação de transformação, embora o rendimento possa ser muito menor para outras cepas (Figura 4).
- Armazene as placas de fermento por um curto prazo (geralmente 1-3 semanas) de cabeça para baixo e cobertas a 4 ° C. Prepare estoques de glicerol de levedura transformada conforme descrito em 1.2.5 para armazenamento de longo prazo.
NOTA: Mais estudos testando UFC transformada são necessários para determinar a estabilidade do plasmídeo e avaliar a expressão adequada da proteína heteróloga. Descrições completas da estabilidade do plasmídeo, uso de immunoblotting para detectar proteínas desnaturadas recuperadas de amostras de células, ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) para detectar proteínas tridimensionais adequadamente dobradas e o uso de GFP em estudos de levedura estão disponíveis em outros lugares. A Figura 5 mostra uma imagem representativa da expressão bem-sucedida de GFP em S. cerevisiae transformadaem relação às células não transformadas. O uso de tal proteína fluorescente é um meio de determinar com eficiência a produção bem-sucedida de proteínas heterólogas.
- Eletroporação de levedura
- Inocular colónias de leveduras isoladas em 5-10 ml de meio YPD e incubar num tambor de rolos a 30 °C O/N.
- Determine a concentração celular usando um espectrofotômetro para medir uma diluição de 1:10 de células em água estéril. Diluir as culturas O/N em 100 ml de meio YPD fresco e quente até obter um equivalente a OD600 de aproximadamente 0,3. Incubar subculturas a 30 °C em um agitador de plataforma orbital ajustado para 200 rpm até atingir um OD600 de aproximadamente 1,6, geralmente 4-5 horas. Cada subcultura de 100 ml gerará células condicionadas suficientes para duas reações de transformação.
- Células de pellets por centrifugação a 2.500 x g por 3 min. Aspirar o sobrenadante e lavar as células ressuspendendo em 50 ml de água estéril gelada. Repita a lavagem peletizando as células, aspirando o sobrenadante e ressuspendendo em água fresca e estéril gelada de 50 ml.
- Pulverizar novamente as células e ressuspender em 50 ml de tampão de eletroporação gelado (1 M de Sorbitol, 1 mM de cloreto de cálcio (CaCl2)).
- Repetir o centrifugação como em 2.2.3, aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em 20 ml de 0,1 M de LiOAc/10 mM de ditiotreitol (TDT). Incubar a suspensão celular em um tambor de rolos a 30 °C por 30 min. A pré-incubação de células em LiOAc e DTT aumenta sinergicamente a eficiência da eletroporação.
- Esfolar as células como indicado no ponto 2.2.3, remover o sobrenadante e lavar ressuspendendo em tampão de electroporação gelado de 50 ml. Repetir a centrifugação e ressuspender as células em tampão de electroporação gelada até obter um volume final de 1 ml.
- Prepare no gelo: células de levedura condicionadas, cubetas de eletroporação estéreis e DNA de plasmídeo. Imediatamente após a ressuspensão final das células condicionadas em 1 ml de tampão de eletroporação, combine 400 μl de células de levedura condicionadas com aproximadamente 1 μg de DNA de plasmídeo e adicione a uma cubeta de eletroporação gelada de 0,2 μm. O uso de quantidades aumentadas de DNA pode aumentar ligeiramente a eficiência da transformação. Incube a reação no gelo por 5 min e, em seguida, eletropore com o eletroporador ajustado para 2,5 kV e 25 μF.
NOTA: Tal como descrito no ponto 2.1.7, uma estirpe de levedura mutante sem um marcador auxotrófico pode ser transformada com apenas um plasmídeo que codifica o marcador mutado por amostra. Além disso, o uso de um plasmídeo que codifica uma proteína facilmente detectável, como a GFP, permite a determinação eficiente do dobramento adequado e da expressão de proteínas heterólogas após a transformação.
- Transferir as células eletroporosas para 8 ml de uma mistura 1:1 de sorbitol YPD:1 M e deixar incubar as células num tambor de rolos a 30 °C durante 60 min.
- Células em péllete como em 2.2.3 e ressuspendem em 100 μl 1:1 YPD:1 M sorbitol. Plaquear todo o volume em meio seletivo contendo sorbitol 1 M, enrolar as bordas das placas em Parafilm e incubar as placas de cabeça para baixo a 30 ° C por 2-5 dias para permitir o crescimento de células de levedura transformadas.
NOTA: É fundamental testar leveduras transformadas para avaliar a expressão adequada de proteínas heterólogas, conforme descrito em 2.1.14 e 2.2.7.
- Gavagem Oral de Camundongos com Levedura Transformada
- Realizar todos os procedimentos de cuidado e manejo de animais de acordo com a aprovação do Guia para Cuidados e Uso de Animais de Laboratório e do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais.
- Prepare culturas de levedura O/N inoculando colônias únicas de levedura auxotrófica transformada em 5-10 ml de meio seletivo. Incubar culturas O/N durante pelo menos 8 horas num tambor de rolos a 30 °C até saturar.
NOTA: O uso de proteínas de teste de codificação de plasmídeo, como GFP, permitirá facilitar o teste de expressão de proteínas em leveduras gavadas, conforme descrito em 4.7.
- Para uma indução máxima da expressão proteica e para induzir o crescimento da fase logarítmica, preparar as subculturas das culturas O/N diluindo até um equivalente OD600 de aproximadamente 0,16-0,2 em 50 ml de meios adequados, conforme descrito no ponto 2.1.2.
- Determinar a concentração de células subcultivadas como indicado em 1.1.2 e ajustar para 109 células/ml. Preparar uma dose de 100 μl para cada ratinho, com algumas centenas de μl de volume suplementar por grupo para melhorar a precisão e a facilidade de carregamento das amostras.
- Células de pellets por centrifugação a 2.500 x g por 3 min ou em uma microcentrífuga a 16.000 x g por 1 min. Aspire as células sobrenadantes e ressuspenda adicionando um volume igual de água estéril e pipetando suavemente para cima e para baixo.
- Fixar uma agulha de sonda gástrica apropriada (22 g para ratinhos de 15-20 g) numa seringa estéril de 1 ml e carregar a amostra de levedura, certificando-se de eliminar quaisquer bolhas e ajustar o êmbolo para um incremento de 100 μl. Carregue uma seringa adicional com água estéril para gavagar os ratos de controle e verifique a presença de qualquer levedura contaminante.
- Pegue o mouse a ser gavagizado usando a mão não dominante, com o dedo indicador e o polegar segurando firmemente a pele ao redor do pescoço (Figura 5A). Coloque a cauda sob o dedo mindinho para evitar o movimento da parte inferior do corpo. Certifique-se de que a empunhadura esteja segura e proíba o mouse de mover a cabeça para evitar danos aos tecidos internos durante a gavagem.
NOTA: Estime até que ponto a agulha de gavagem deve ser inserida segurando a agulha contra o mouse de forma que o bulbo fique nivelado com o processo xifóide do esterno. A inserção desse comprimento da agulha normalmente permitirá que o bulbo da agulha de gavagem entre no estômago.
- Usando a mão dominante, insira suavemente a agulha de gavagem no esôfago do camundongo, inclinando a agulha ao longo do céu da boca e da parte de trás da garganta, mantendo-se ligeiramente à esquerda do centro. Esperar que o rato engula o bolbo da agulha e deixar que a agulha desça um pouco mais até ao ponto estimado em 3.7 (figura 5B). Se alguma resistência for sentida durante a inserção da agulha de gavagem ou se o mouse a qualquer momento começar a ofegar, remova suavemente a agulha e tente novamente encontrar o esôfago.
- Depois que o camundongo engolir o bulbo da agulha de gavagem, pressione suavemente o êmbolo da seringa para administrar 100 μl (108 UFC) de levedura diretamente no estômago do camundongo.
NOTA: Embora os camundongos não consigam vomitar nenhuma solução gavagem após a administração, é possível que ocorra refluxo durante a gavagem. A inserção adequada da agulha de gavagem, bem como o ajuste do volume e da viscosidade da solução, podem ajudar a limitar o refluxo e garantir uma dosagem precisa.
- Remova cuidadosamente a agulha de gavagem do estômago e do esôfago do camundongo e retorne o camundongo à gaiola. Verifique se o mouse está respirando e se movendo normalmente após a gavagem para garantir que a agulha de gavagem foi inserida corretamente durante todo o procedimento e que nenhuma solução foi aspirada.
Tabela 1. Lista de reagentes. Descritos são os reagentes necessários para fazer cada uma das soluções, meios e placas de levedura e tampões de transformação usados para os protocolos neste manuscrito.
| Soluções | Meios e placas de levedura | Reagentes de transformação |
| Polietilenoglicol (PEG) 50%: | YPD: | TE/LiOAc: |
| 250 g PEG 3350 | 20 g de peptona | 50 ml 10x TE |
| 500 ml de água estéril | 20 g de dextrose | 50 ml 10x (1M) LiOAc |
| Filtro esterilizado | 10 g de extrato de levedura | 400 ml de água estéril |
| 1 L de água | Filtro esterilizado |
| autoclave | |
| TE 10x: | Placas YPD: | PEG/TE/LiOAc: |
| 100 mM Tris | 20 g de peptona | 400 ml 50% PEG |
| EDTA de 10 mM | 20 g de dextrose | 50 ml 10x TE |
| pH para 7,5 e esterilização por filtro | 20 g de ágar | 50 ml 10x (1M) LiOAc |
| 10 g de extrato de levedura | |
| 1 L de água | |
| autoclave | |
| 20% de glicose: | Meios seletivos de uracila | DNA transportador (DNA SS): |
| 200 g de dextrose | 2 g de mistura de aminoácidos sem uracila | Armazene a -20 °C e antes de usar aqueça por 1-2 min a 100 °C para derreter os fios e armazene no gelo |
| 1 L de água | 6,7 g de base de nitrogênio de levedura sem aminoácidos | |
| Filtro esterilizado | 1 L de água | |
| Esterilizar por autoclavagem ou filtragem estéril | |
| Adicione 20% de glicose 1:10 antes de usar | |
| 50% de glicerol: | Placas de uracila: | Tampão de eletroporação: |
| 500 ml de glicerol | Num balão de 250 ml: | 1 M Sorbitol |
| 500 ml de água | 2 g de mistura de aminoácidos sem uracila | 1 mM CaCl2 |
| autoclave | 6,7 g de base de nitrogênio de levedura sem aminoácidos | Encha com água destilada |
| 150 ml de água | Autoclave e armazene a 4 °C |
| Num balão de 2 l: | |
| 20 g de ágar | |
| 750 ml de água | |
| Frascos de autoclave separadamente e, em seguida, misture com 100 ml de glicose a 20% | |
| IMDM completo | Placas 5-FOA+: | LiOAc/TDT |
| 500 ml de Meio Dulbecco Modificado de Iscove | Autoclave em balão de 2 l: | 0,1 M LiOAc |
| 5 ml de penicilina estreptomicina glutamina 100x | 20 g de ágar | 10 mM TDT |
| 500 μl de 2-mercaptoetanol | 750 ml de água | |
| Soro fetal bovino inativado por calor a 10% | misturar: | |
| 2,5 ml de piruvato de sódio 100 mM | 6,7 g de base de nitrogênio de levedura sem aminoácidos | |
| 2 g de mistura de aminoácidos sem uracila | |
| 150 ml de água morna | |
| Quando esfriar, adicione: | |
| 0,05 g de uracila em pó | |
| 1 g de 5-FOA | |
| Mexa e filtre esterilize | |
| Adicionar à solução de ágar autoclavada | |
| Misture com 100 ml de glicose a 20% | |
