Geração de neutrófilos antiangiogênicos associados a tumores

Resumo

Fonte: Pylaeva, E., et al. Transferência de neutrófilos manipulados associados a tumores em camundongos portadores de tumor para estudar seu potencial angiogênico in vivo. J. Vis. Exp. (2019).

Este vídeo demonstra um ensaio para gerar neutrófilos associados a tumores (TANs) antiangiogênicos. Ao tomar um tumor de melanoma murino contendo TANs pró-angiogênicos, as células individuais são isoladas usando classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) e tratadas com um inibidor da nicotinamida fosforibosil transferase (NAMPT) para reduzir a capacidade de estimular a angiogênese.

Protocolo

Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.

NOTA: O esquema geral do protocolo é mostrado na Figura 1.

1. Preparação da linha celular de melanoma B16F10

1. Prepare células micoplasmáticas negativas cultivadas em monocamada confluente de 90% (aproximadamente 10 x 10⁶ células/frasco T75) em meio completo de Dulbecco modificado de Iscove (IMDMc: IMDM + 10% de soro fetal bovino (FBS) + 1% de penicilina-estreptomicina).
2. Remova o meio e enxágue as células com solução salina tamponada com fosfato (PBS). Aplique 6 mL de uma solução de descolamento celular contendo enzimas proteolíticas e colagenolíticas (consulte a Tabela de Materiais) e incube a 37 ° C por 2 min.
3. Bata suavemente no frasco para mobilizar as células aderentes restantes do fundo. Recolha a suspensão celular em tubos de 15 ml e centrifugue a 300 x g durante 7 min e 20 °C.
4. Remova o sobrenadante e ressuspenda bem o pellet em 1 mL de PBS. Adicione 14 mL de PBS e centrifugue (300 x g e 20 °C por 7 min).
5. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 1 mL de PBS.
6. Conte as células e ressuspenda-as até a concentração de 3 x 10⁶ / mL PBS (para a etapa 2) ou 6 x 10⁶ / mL PBS (para a etapa 6) para injeção. Mantenha as células no gelo por no máximo 30 min.

2. Modelo tumoral alogênico em camundongos

1. Use 10 camundongos Ifnar1-/- fêmeas de 8 a 12 semanas de idade que são mantidos em condições livres de patógenos específicos (SPF).
   nota: Camundongos fêmeas são preferíveis em um modelo subcutâneo de crescimento tumoral, uma vez que os machos são mais agressivos e, portanto, propensos a infrações do local do tumor, o que influencia o crescimento do tumor.
2. Raspe a pele do camundongo no flanco com um barbeador elétrico e desinfete a pele com tecido úmido com etanol a 70%.
3. Colete as células de melanoma B16F10 preparadas a uma concentração de 3 x 10⁶ / mL PBS (consulte a etapa 1) em uma seringa de 1 mL e agulha de 0,4 x 19 mm. Injetar 100 μL da suspensão por via subcutânea.
   1. Misture bem as células antes de cada injeção. Use agulhas com pelo menos 0,4 mm de diâmetro para não perturbar as células tumorais.
4. Coloque até 5 camundongos em uma gaiola e controle o tamanho do tumor (comprimento, largura e profundidade) com um paquímetro por 14 dias.
   nota: De acordo com os regulamentos animais, o tamanho do tumor não deve exceder 15 mm de diâmetro, camundongos com tumores maiores ou necróticos/abertos devem ser sacrificados previamente.
5. No dia 14, sacrifique os camundongos na câmara de CO₂.
6. Desinfete a pele com etanol a 70% e remova os tumores com tesoura e pinça em uma placa de Petri estéril. Mantenha os tumores em um tubo de 50 mL em meio Eagle modificado completo de Dulbecco (DMEMc: DMEM + 10% FBS + 1% penicilina-estreptomicina) no gelo.

3. Isolamento TAN

1. Coloque os tumores em placas estéreis de 6 poços, 5 tumores por poço. Corte os tumores em pedaços de 2-3 mm com uma tesoura estéril.
   1. Digerir com 1 mL de solução de dispase/colagenase D/DNase I (0,2 mg/0,2 mg/100 mg em 1 mL de DMEMc) por tumor. Incubar a 37 °C, 5% de CO₂ em uma incubadora úmida e misturar com uma seringa de 10 mL sem agulha a cada 15 min 3 vezes.
2. Para remover fibras não digeridas, faça malha de células através de filtros de 100 μm em tubos de 15 mL (um poço por filtro por tubo). Adicionar PBS a 15 ml, tubos de centrifugação a 460 x g, 4 °C durante 5 min e remover o sobrenadante.
3. Lise eritrócitos com um tampão de lise (NH₄Cl 150 mM, KHCO₃ 10 mM, EDTA 0,1 mM, pH 7,3, 20 ° C) adicionando 1 mL em cada tubo. Misture bem e combine a solução de todos os tubos em um. Pare a reação após 2 minutos com 11 mL de DMEMc gelado (4 ° C).
4. Centrifugar a 460 x g, 4 °C durante 5 min, e remover o sobrenadante. Ressuspenda o pellet com 15 mL de PBS frio. Centrifugar a 460 x g, 4 °C durante 5 min, e remover o sobrenadante.
5. Ressuspenda o pellet em 1 mL de PBS. Adicione 3 μL de anticorpos do bloqueio Fc (CD16 / CD32, estoque de 0,5 mg / mL) e incube no gelo por 15 min.
6. Adicione anticorpos: 10 μL de Ly6G-ficoeritrina (Ly6G-PE, estoque 0,2 mg / mL) e 10 μL de CD11b-aloficocianina (CD11b-APC, estoque 0,2 mg / mL). Adicione 20 μL de corante de viabilidade 6-Diamidin-2-fenilindol (DAPI, estoque 5 mg / mL) e incube em gelo no escuro por 30 min.
   nota: Outra combinação de corantes de viabilidade e conjugados fluorescentes de anticorpos pode ser usada.
7. Adicionar PBS até 15 ml, centrifugar a 460 x g, 4 °C durante 5 min e remover o sobrenadante.
8. Ressuspenda o pellet em DMEMc até a concentração de aproximadamente 10 x 10⁶ / mL e mantenha no gelo.
9. Classifique os neutrófilos CD11b ⁺ Ly6G^hi alive (DAPI-negativos) com um classificador de células ativado por fluorescência (estratégia de gating, consulte a Figura 2).
   nota: Manter o tubo com suspensão de células e o tubo com DMEMc para células classificadas a 4 °C. Utilizar as seguintes configurações de ordenação óptimas: um bico de 70 μm, um débito limiar máximo de 22.000 eventos/segundo e um caudal de 1-3.
10. Verifique a pureza dos neutrófilos classificados usando um citômetro para obter uma pureza recomendada de >95%.
11. Centrifugar neutrófilos separados a 460 x g, 4 °C durante 5 min, e remover o sobrenadante. Ressuspenda as células classificadas em DMEMc até a concentração de 1 x 10⁶/mL.
    nota: O número esperado de neutrófilos em um tumor B16F10 de 14 dias (10 mm de diâmetro) é de aproximadamente 3 x 10⁴ células.

4. Inibição de NAMPT em TANs in vitro

1. Preparar o estoque de FK866 (inibidor de NAMPT) em dimetilsulfóxido (DMSO) a uma concentração final de 100 mM.
2. Semeie neutrófilos classificados (etapa 3.11) em 2 poços de uma placa de fundo em U de 96 poços (1,5 x 10,⁵ neutrófilos/poço). Adicione FK866 ao poço de intervenção (concentração final de 100 nM) e uma quantidade igual de DMEMc com DMSO ao poço de controle. Incubar durante 2 h a 37 °C, 5% de CO₂ numa incubadora húmida.
3. Centrifugar a 460 x g, 4 °C durante 5 min, e remover o sobrenadante. Ressuspender em 200 μL de PBS em cada poço. Repita 2 vezes.
4. Centrifugar a 460 x g, 4 °C durante 5 min, e remover o sobrenadante. Ressuspender em meio comercial de crescimento de células endoteliais (suplementado com 4 μL/mL de suplemento de crescimento de células endoteliais, 0,1 ng/mL de fator de crescimento epidérmico humano recombinante, 1 ng/mL de fator de crescimento de fibroblastos humanos básicos recombinante, 90 μg/mL de heparina e 1 μg/mL de hidrocortisona) até uma concentração final de 0,2 x 106 células/mL (em 0,75 mL) (para a etapa 5) ou em PBS até a concentração final de 0,6 x 10,6 6 células/mL ( em 0,25 mL).

Resultados

Figura 1. O esquema do protocolo. Passo 1. Preparação da linhagem celular de melanoma B16F10; 2. Modelo tumoral alogênico em camundongos; 3. Isolamento de TANs dos tumores; 4. Inibição de NAMPT em TANs in vitro; 5. Estimativa das propriedades angiogênicas das TANs no ensaio do anel aórtico; 6. Transferência adotiva de neutrófilos tratados no modelo de tumor alogênico; 7. Monitoramento do crescimento ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubos de 15 ml	Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Alemanha	6,25,54,502
Tubos de 50 ml	Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Alemanha	227261
Pontas estéreis de 5ml / 10ml / 25ml para a pipeta automática	Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Alemanha	6006180 / 607180 / 760180
6 placas de cultura de células de fundo plano de poço	Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Alemanha	8,33,920
96 placas de cultura de células de fundo plano de poço	Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Alemanha	Nº 655180
Placas de cultura de células com fundo em U de 96 poços	Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Alemanha	Nº 65018
anti-mouse CD11b	BD Pharmigen, Becton Dickinson, Franklin Lakes, EUA	553312	clone M1/70, conjugado com APC, 0,2mg/mL
anti-mouse Ly6G	BioLegend, Califórnia, EUA	127608	clone 1A8, conjugado com PE, 0,2 mg / mL
BD FACS AriaII	BD Biosciences, Becton Dickinson, Franklin Lakes, EUA		Classificador de células
pinça	Vogel Alemanha, Kevelaer, Alemanha
Contador de células Casy	Innovatis, Roche Innovatis AG, Bielefeld, Alemanha
Filtros estéreis Cell Trics 50μm / 100 μm	Sysmex Partec GmbH, Goerlitz, Alemanha	04-004-2327 / 04-004-2328
Centrífuga Rotina 420 R	Andreas Hettich, Tuttlingen, Alemanha	Nº 4706
Colagenase D	Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Alemanha	11088858001
DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindol, Dilactato)	BioLegend, Califórnia, EUA	422801	Estoque: 5mg/ml
Dispersão I	Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Alemanha	D4818-2MG
DMEM	Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, EUA	Rolamento 41966-029	DMEM completo: DMEM + 10% FBS + 1% de penicilina-estreptomicina
DMSO (Dimetilsufoxida)	WAK-Chemie Medical GmbH, Steinbach, Alemanha	WAK-DMSO-10	CryoSure-DMSO
DNase I	Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Alemanha	DN25-100MG
DPBS	Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, EUA	14190-094
Meio de crescimento de células endoteliais	PromoCell, Heidelberg, Alemanha	C-22010
FBS (Soro Fetal Bovino)	Biochrom, Berlim, Alemanha	S0115
Bloco FC (Anti-mouse CD16/32)	BD Pharmingen, Becton Dickinson, Becton Dickinson, Franklin Lakes, EUA	553142	clone 2.4G2, estoque: 0.5mg/mL
Cloridrato de FK 866	Axon Medchem, Groningen, Países Baixos	Axônio 1546	Estoque: 100 mM
IgG Anti-Coelho para Cabras H&L	Abcam, Cambridge, Reino Unido	AB97075	Cy3-conjugado, estoque: 0,5 mg / mL
Incubadora de CO2 Heracell 240i	Thermo Fisher Scientific, Waltham, EUA	51026334
IMDM	Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, EUA	Rolamento 12440-053	IMDM completo: IMDM + 10% FBS + 1% de penicilina-estreptomicina
Barbeador Isis GT420	B. Braun Asculap, Suhl, Alemanha	90200714
Membrana basal Matrigel Matrix	Corning Life Sciences, Amsterdã, Holanda	7205011
Anti-actina monoclonal, músculo liso α	Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Alemanha	F3777	Conjugado com FITC, sem informação sobre a concentração de stock
Agulhas 0,4 mm x 16 mm	BD Microlance, Becton Dicson, Becton Dickinson, Franklin Lakes, EUA	Rolamento 302200
Neomount	Merck, Darmstadt, Alemanha	HX67590916
Soro de cabra normal	Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, EUA	005-000-121
Penicilina estreptomicina	Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, EUA	15140-122
Pipeta automática Pipetus	Hirschmann Laborgeräte, Eberstadt, Alemanha	Rolamento 9907200
ProLong Gold Antifade Mountant com DAPI	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, EUA	Pág. 36935
coelho anti rato Laminina gama 1 cadeia	Immundiagnostik, Bensheim, Alemanha	AP1001.1	Nenhuma informação sobre a concentração de ações
Haste Accutase	Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, EUA	A1105-01
Bisturi de eliminação estéril (n.º 15)	MedWare, Nápoles, EUA	Rolamento 120920
Seringas 1 ml	BD Plastipak, Becton Dickinson, Franklin Lakes, EUA	303172
Seringas 10 ml	BD Discardit II, Becton Dickinson, Franklin Lakes, EUA	Rolamento 309110
Frascos de cultura de células estéreis T75	Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Alemanha	83,39,11,302