Uma técnica de conjugação Avidina-Biotina para Apresentação de Antígenos-Alvo em Mycobacterium bovis BCG

Resumo

Fonte: Liao, T. A., et al., Expressão de Antígenos Exógenos na Vacina Mycobacterium bovis BCG via Decoração de Superfície Não Genética com o Sistema Avidina-biotina. J. Vis. Exp. (2018).

O vídeo demonstra uma técnica de carregamento de antígenos no Mycobacterium bovis BCG para melhorar suas propriedades imunogênicas. O método usa o sistema avidina-biotina para revestir a superfície bacteriana com antígenos exógenos.

Protocolo

1. Biotinilação da superfície celular BCG

1. Cultive BCG em caldo Middlebrook 7H9 com 10% de OADC (solução de ácido oleico, albumina e dextrose) e 0,05% de Tween 80 a 37 °C em uma plataforma agitadora a 50 rpm até OD = 0,5-1,
   NOTA: O BCG é um patógeno de nível 2 de biossegurança e todos os experimentos relacionados ao BCG devem ser feitos em um gabinete de biossegurança com equipamento de proteção individual adequado.
2. Lave 10⁹ BCG 3 vezes com 500 μL de PBS livre de endotoxinas geladas mais 0,1% de Tween80 (PBST) (pH 8,0). Suspenda o pellet de BCG em PBS estéril livre de endotoxinas.
3. Imediatamente antes de usar, prepare 1 mL de 10 mM de biotina Sulfo-NHS SS em água filtrada estéril.​
   1. Incube bactérias com 1 mL de 0,5 mM de biotina Sulfo-NHS SS em temperatura ambiente por 30 min.
4. Lave as bactérias marcadas 3 vezes com 500 μL de PBST gelado frio para remover o reagente de biotinilação não reagido.
   1. Ressuspenda o pellet em 1 mL de PBST.

2. Ligação da proteína de fusão de avidina monomérica à superfície de BCG biotinilada

1. Misture 5 x 10⁸ BCG biotinilado com proteína Avi (10 μg / mL final em PBS-T) por 1 h em temperatura ambiente na plataforma do agitador.
2. Lave as bactérias 3 vezes com 500 μL de PBST gelado.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
RPMI 1640 livre de endotoxinas	Tecnologias de células-tronco	Rolamento 36750
Sulfo-NHS SS biotina	Thermo Fisher	Rolamento 21328
Caldo Middlebrook 7H9	Sistemas de diagnóstico BD	Rolamento 271310
OADC	Sistemas de diagnóstico BD	B11886
Pré-adolescente 80	Sigma-Aldrich	Pág. 1379