Um ensaio para analisar o teste β-glucano como estratégia de imunoterapia contra células cancerígenas cerebrais

Resumo

Fonte: Folgado-Dorado, C. et al., Isolamento e Purificação de β-Glucano Fúngico como Estratégia de Imunoterapia para Glioblastoma. J. Vis. Exp. (2023)

Este vídeo demonstra um ensaio in vitro utilizando β-glucanos para ativar células microgliais para a produção de radicais superóxido, uma espécie reativa de oxigênio. Nas células cancerígenas cerebrais, os oxidantes reativos gerados suprimem ativamente a proliferação de células tumorais e induzem a morte celular.

Protocolo

Estudo in vitro da estimulação da microglia induzida por β-glucano

1. Cultura celular de glioblastoma de camundongo e células de microglia em lâminas de câmara de 8 poços

NOTA: Este protocolo é específico para as linhagens celulares GL261 (glioblastoma) e BV2 (microglia). No entanto, com pequenas modificações, essas etapas podem ser usadas para estudar outras linhagens de células cancerígenas e imunológicas.

1. Prepare o meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) modificado com L-glutamina, 4,5 g/L de D-glicose e sem piruvato. Adicione 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina/estreptomicina. Pré-aqueça o material em banho-maria a 37 °C por 15 min.
2. Descongele as alíquotas BV2 e GL261 congeladas em banho-maria (37 °C) por 2 min e, imediatamente antes de descongelarem completamente, leve-as para uma capela de fluxo laminar e coloque as células em dois frascos T25 estéreis diferentes (um para cada linha celular).
3. Incubar os frascos T25 a 37 °C, CO₂ a 5% até que a cultura seja confluente.
   nota: Dependendo das condições de congelamento e do tempo sob criopreservação, o tempo até a confluência pode variar. Essas linhagens celulares geralmente requerem entre 3 a 5 dias para atingir a confluência em um frasco T75.
4. Depois que a cultura de células BV2 se tornar confluente, transfira-a para lâminas de câmara de 8 poços 0,6 x 10⁶ células/poço. Mantenha as lâminas da câmara de 8 poços na incubadora por 24 h.
5. Uma vez que as células da microglia são colocadas nas lâminas da câmara de 8 poços, repita o mesmo protocolo com as células GL261.

2. Ativação da microglia com β-glucanos

1. Revestir as células BV2 com quatro β-glucanos diferentes (P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum e H. erinaceus) a uma concentração de 0,2 mg / mL por 72 h. Uma condição experimental deve permanecer sem tratamento (meio normal), atuando como grupo controle.
2. Recolher o sobrenadante com uma pipeta após 72 h e passar o volume restante através de um filtro de seringa de 0,20 μm. Em seguida, congelar o sobrenadante a -80 °C durante, pelo menos, 24 h.

3. Tratamento de GL261 com meio pré-ativado condicionado por microglia

1. Uma vez que o GL261 esteja 80% confluente dentro das lâminas da câmara de 8 poços, adicione meio microglial tratado com β-glucano a uma concentração de volume final de 25% por 72 h (volume total: 250 μl/poço).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Corrediças de câmara de 8 poços	Thermo Fisher, EUA	Rolamento 171080
Meio de Eagle modificado de Dulbecco, Gluta MAXTM	Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA	10564011
Extenda (α-amilase/glucoamilase)	Novozymes, Dinamarca
Soro fetal bovino	Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA	A4736301
Solução salina tamponada com fosfato	Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA	1010-015
Penicilina/estreptomicina	Sigma-Aldrich, St. Louis	Pág. 4458
incubadora	Eppedorf	Galáxia 170S