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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Isolamento de baços de camundongos
- Prepare 1640 RPMI (Roswell Park Memorial Institute): 10% de soro fetal bovino (FBS), 0,10 mM de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfônico (HEPES), 1 mM de piruvato de sódio, 50 μM de β-mercaptoetanol e 1% de penicilina/estreptomicina.
- Eutanasiar camundongos machos C57bl/6 de 10 a 12 semanas de idade por inalação de CO2. Pulverize o peito e as laterais do mouse com etanol 70%. No lado esquerdo, abra cuidadosamente a pele e a cavidade peritoneal para expor o baço.
- Usando uma pequena pinça, mova cuidadosamente os intestinos e o fígado para o lado esquerdo do camundongo e, usando uma tesoura fina, excise suavemente o baço.
nota: Esta etapa deve ser feita com muito cuidado, pois danos ao trato gastrointestinal podem induzir contaminação.
- Coloque cada baço excisado em um tubo cônico de 15 mL rotulado contendo 3 mL de meio RPMI 1640.
2. Geração de suspensões unicelulares a partir de baços
NOTA: O baço pode ser dissociado em uma suspensão unicelular combinando dissociação mecânica mais digestão enzimática.
- Prepare a solução de digestão do baço adicionando colagenase D (1 mg / mL; 0,29 U / mg liofilizado) e DNase I (0,1 mg / mL) ao meio RPMI 1640 preparado (consulte a etapa 1.1)
- Use uma pinça para transferir o baço para um tubo C (tubo de dissociação) contendo 3 mL de solução de digestão do baço.
- Realizar a dissociação mecânica utilizando um homogeneizador semiautomático de acordo com as instruções do fabricante.
- Coloque o tubo C no homogeneizador semi-automatizado, certificando-se de que o tubo C esteja firmemente colocado no braço giratório. Uma vez colocado o tubo C, pressione o botão Iniciar no homogeneizador semi-automatizado para executar o protocolo Spleen 04.01 por 60 s.
NOTA: A dissociação mecânica também pode ser realizada colocando um filtro de 40 μm em cima de um tubo cônico de 50 mL e triturando suavemente o baço através do filtro. Depois de triturar o baço, enxágue o filtro de 40 μm com 10 mL de meio RPMI.
- Após dissociação mecânica, separar o tubo do homogeneizador e realizar a digestão enzimática. Incubar as amostras durante 15 min a 37 °C sob rotação contínua (20 rpm).
- Transferir a solução pipetando-a para um tubo cónico de 50 ml após filtração através de um filtro de 40 μm. Lave o filtro de 40 μm com 10 mL de PBS de Dulbecco (dPBS). Centrifugar as células a 300 x g durante 10 min a 4 °C.
- Após centrifugação, aspirar completamente o sobrenadante e lavar o sedimento ressuspendendo-o em 10 ml de dPBS. Centrifugue a 300 x g durante 10 min a 4 °C.
3. Isolamento de CD11c+ DCs da suspensão esplênica de célula única
- Ressuspenda o pellet celular em 5 mL de dPBS e conte o número de células usando um hemocitômetro e exclusão de azul de tripano.
- Pulverizar as células centrifugando a 300 x g, durante 10 min a 4 °C.
- Aspirar completamente o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 400 μL de tampão de classificação de células activadas magneticamente (MACs).
- Adicione 100 μL de microesferas CD11c (ver Tabela de Materiais) por 1 x 108 células.
- Vortex a suspensão celular e incubar por 10 min na geladeira a 4 °C.
- Adicione 10 mL de tampão MACs para lavar as células. Centrifugue a 300 x g durante 10 min a 4 °C.
- Aspirar completamente o sobrenadante e ressuspender em 500 μL de tampão MACs.
4. Separação Magnética de CD11c+ DCs
NOTA: A separação magnética é feita manualmente com um separador magnético (consulte a Tabela de Materiais) equipado com Colunas LS. A separação magnética também pode ser feita automaticamente com um separador magnético automatizado. (ver Tabela de Materiais).
- Coloque a coluna LS no campo magnético do separador MACs e um tubo cônico de 15 mL sob cada coluna para coletar o fluxo.
- Enxágue a coluna LS com 3 mL de tampão.
- Coloque a suspensão de células em cada coluna LS e colete o fluxo contendo células não rotuladas.
- Lave a coluna LS com 3 mL de tampão MACs, coletando as células não marcadas que passam. Lave a coluna LS mais 2 vezes.
- Remova a coluna LS do separador magnético. Adicione 5 mL de tampão MACs a cada coluna e lave imediatamente as células marcadas magneticamente, mergulhando firmemente a coluna LS em um tubo cônico limpo de 15 mL.
nota: É importante realizar um duplo isolamento de células CD11c para obter uma suspensão celular de alta pureza. Portanto, repita as etapas 3.1 a 4.5. e referência à Figura 4 para padrões de pureza. Esta etapa melhora a pureza das células CD11c + para 90-95%.
- Determine o número de CD11c+ DC em um hemocitômetro usando a exclusão de azul de tripano. Diluir a amostra de células em uma diluição de 1:1 em solução de azul de tripano a 0,4%.
NOTA: As células não viáveis serão coradas de azul, enquanto as células viáveis permanecerão não coradas.
- Para fazer isso, encha cuidadosamente um hemocitômetro com 10 μL da diluição da amostra de células e incube por 1 minuto.
- Conte as células em 4 quadrados de 1 x 1 mm2 na câmara que foi carregada para determinar o número de células viáveis.
5. Tratamento in vitro com alto teor de sal de CD11c+ DCs
- Prepare o meio de cultura DC adicionando 10% de FBS, HEPES 0,1 mM, piruvato de sódio 1 mM, β-mercaptoetanol 50 μM e penicilina/estreptomicina a 500 mL 1640 RPMI.
- Prepare 10x meios de cultura de células com alto teor de sal DC (400 mM) pesando 1,17 g de NaCl e colocando-o em um tubo de falcão estéril de 50 mL. Adicione 50 mL de meio de cultura de células DC estéreis (preparado na etapa 5.1) ao tubo de falcão de 50 mL e ao vórtice até que o NaCl esteja em solução.
- Filtre imediatamente o meio de cultura CC com alto teor de sal usando filtração a vácuo através de um filtro de 0,2 μm em uma capela de cultura de células.
- Centrifugue cada suspensão celular dos baços a 300 x g por 10 min a 4ºC. Ressuspenda cada pellet celular em meio de cultura DC a uma concentração de 1 x 106 células / mL.
- Pipetar 900 μL (aproximadamente 1 x 106 células) da suspensão CC em uma placa Falcon de fundo plano de 24 poços. Adicione 100 μL de meio de cultura DC com alto teor de sal a cada poço para obter uma concentração final de sódio de 190 mM. Rotular a placa e colocá-la numa incubadora de CO2 humificado a 37 °C durante 48 h.
6. Transferência Adotiva de DCs CD11c+ tratadas com alto teor de sal
- Após estimulação in vitro por 48 h, remova a placa da incubadora de CO2 humificado a 37 °C.
- Pipete o meio de cultura de células para cima e para baixo para ressuspender os CD11c + DCs. Pipete toda a suspensão CD11c + DC em um tubo correspondente rotulado de 1,6 mL. Repita esta etapa para cada poço individual.
- Centrifugar cada suspensão CD11c+ DC a 300 x g durante 10 min a 4 °C. Aspirar o sobrenadante. Ressuspenda o pellet DC com 100 μL de dPBS estéril.
- Puxe a suspensão DC em uma seringa de 1 mL equipada com uma agulha de 27 G 1/2 polegada.
- Coloque os camundongos C57bl/6 machos virgens de 10 semanas de idade sob 2% de isoflurano para obter um plano cirúrgico estável. Verifique o nível de anestesia com a falta de reflexo podal. Uma vez alcançado um plano cirúrgico estável, introduza lenta e cuidadosamente a agulha no espaço retro-orbital em um ângulo de aproximadamente 30°.
nota: O bisel da agulha 27 G deve estar virado para baixo, longe do olho, para evitar danos oculares.
- Injete lenta e suavemente a suspensão CD11c+ DC (aproximadamente 1 x 106 células). Assim que a injeção estiver completa, remova cuidadosamente a agulha do espaço retro-orbital, tomando cuidado para não danificar o olho.
nota: Após a injeção, deve haver pouco ou nenhum sangramento. A transferência adotiva de CD11c+ DCs também pode ser realizada usando um método de injeção intravenosa (por exemplo, veia da cauda). Os camundongos controle receberam CD11c+ DCs que foram cultivados em meio de sal normal.
- Remova os camundongos do cone do nariz e monitore-os por aproximadamente 30 minutos durante a recuperação da anestesia.