Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Engenharia e manutenção de linhagens celulares NIT-1
- Manter linhagens celulares NIT-1, que compartilham um histórico genético com camundongos diabéticos não obesos (NOD), e células de 293FT em placas tratadas com cultura de tecidos no Modified Eagle Medium (DMEM) de Dulbecco contendo 4,5 g/L de glicose suplementada com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina/estreptomicina em uma incubadora a 37 °C com 5% de CO2.
- Aumente as células de 293FT para 70% -80% de confluência para transfecção.
- Por placa de 10 cm de células de 293FT, combinar 10 μg de pLenti-luciferase-blast (ver Arquivo Suplementar 1), que expressa o transgene de luciferase de vaga-lume (luc2) sob o controle do promotor EF1α constitutivamente ativo, 2 μg cada um dos plasmídeos de embalagem pMD2.G, pMDLg/pRRE e pRSV-Rev, 4 μg do plasmídeo de proteína de envelope pCMV-VSV-G, e 60 μg de polietilenimina linear (PEI) em 1 mL de DMEM livre de soro. Ajuste as quantidades com base no número de células a serem transfectadas.
- Deixe o DNA, PEI e DMEM em temperatura ambiente (RT) por 20 min e, em seguida, adicione-os às células de 293 pés.
- Colete o meio contendo as partículas lentivirais 48 h após a transfecção.
- Transduza as células NIT-1 em ~ 80% de confluência com 1 mL de meio contendo partículas lentivirais por 106 células por 48-72 h.
- Selecione as células que expressam luciferase com 5 μg / mL de blasticidina por 48 h.
- Além disso, modifique geneticamente as células que expressam luciferase para se adequar à questão experimental. Inclua uma linha celular de controle do tipo selvagem ou não alvo que expresse luciferase para comparação.
nota: Exemplos de modificações do gene alvo incluem nocaute de repetições palindrômicas curtas agrupadas regularmente interespaçadas (CRISPR), CRISPRa/i, knockdown de shRNA e superexpressão.
2. Preparação de células NIT-1 para transplante
- Cultive as células que expressam luciferase até que sejam 80% -90% confluentes.
- Remova o meio de crescimento e lave as células com solução salina tamponada com fosfato (PBS, 5 mL para um prato de 10 cm).
- Adicione 1 mL de ácido tripsina-etilenodiaminotetracético a 0,05% (tripsina-EDTA) a cada prato por 2 min.
- Neutralize a tripsina com 5 mL de meio de crescimento.
- Use uma pipeta para lavar as células do prato e transfira-as para um tubo cônico.
nota: Células de vários pratos da mesma linha celular podem ser combinadas.
- Conte as células usando uma coloração como azul de tripano manualmente com um hemocitômetro ou automaticamente com um contador automático de células.
- Centrifugar a 250 × g durante 5 min em RT e remover o sobrenadante com uma pipeta de aspiração.
- Ressuspenda o pellet celular em PBS a uma concentração de 5 × 107 células/mL (107 células por linha celular por camundongo serão transplantadas em um volume de 200 μL).
- Mantenha as células no gelo (por até 3 h) até o transplante.
3. Transplante de células NIT-1 em camundongos não obesos diabéticos-imunodeficiência combinada grave (NOD-scid)
- Anestesiar os camundongos receptores (camundongos NOD-scid de 8 a 10 semanas de idade do mesmo sexo que os camundongos usados para isolar os esplenócitos) por inalação de isoflurano em uma câmara de knockdown. Forneça 2,5% de isoflurano na câmara a uma taxa de fluxo de 1,5 L/min e uma taxa de evacuação de 9 L/min.
- Lubrifique os olhos do animal com pomada oftálmica para evitar o ressecamento.
- Usando um barbeador elétrico com proteção, remova os pelos da parte de trás (lado dorsal) dos ratos para expor a pele. A área de transplante raspada será de aproximadamente 1 pol x 2 pol. Retorne os camundongos raspados para a câmara de desativação até o transplante.
- Transfira os camundongos um de cada vez para uma superfície limpa com um cone nasal de isoflurano. Guie suavemente a cabeça do mouse no cone do nariz. Use uma taxa de fluxo de isoflurano de 0,25 L/min para manter a anestesia durante o transplante.
- Limpe a área do transplante com uma almofada de preparação com álcool isopropílico para remover os pelos soltos e desinfetar a pele.
- Certifique-se de que as células estejam totalmente ressuspensas antes de carregar a seringa. Aspire um volume excessivo (>300 μL) de células para uma seringa estéril de 1 mL com uma agulha de 26 G. Remova quaisquer bolhas; em seguida, retorne o excesso de células ao tubo para que 300 μL de suspensão celular permaneçam na seringa.
- Usando um par de pinças curvas seguradas na mão não dominante, levante suavemente a pele de um lado (esquerdo ou direito) das costas do camundongo para permitir um acesso mais fácil ao espaço subcutâneo.
- Usando a mão dominante, posicione a seringa paralelamente aos planos coronal e sagital do corpo do camundongo. Com a agulha apontada para a cabeça do camundongo, insira a agulha na pele perto dos quartos traseiros e guie-a suavemente para o espaço subcutâneo. Certifique-se de que toda a agulha permaneça sob a pele e não penetre.
- Ajuste a pinça para segurar suavemente a pele ao redor da base da agulha. Dispense lentamente uma pequena quantidade de suspensão celular (<50 μL) e confirme que uma pequena protuberância se forma sob a pele no local da injeção. Continue injetando a suspensão celular até que 200 μL tenham sido entregues ao espaço subcutâneo.
- Segurando a pinça no lugar e mantendo a agulha paralela ao corpo do mouse, retire lentamente a agulha. Após a remoção da agulha, mantenha a pele fechada com uma pinça por alguns segundos para evitar que as células vazem da ferida da punção.
- Se uma modificação genética estiver sendo avaliada, repita o transplante no lado oposto do camundongo usando uma seringa diferente para que as células mutantes e de controle sejam injetadas em cada camundongo, com uma linha celular à esquerda e a outra à direita. Se apenas uma linhagem celular estiver sendo transplantada, injete as células em apenas um lado.
- Após o transplante, transfira cada camundongo para uma nova gaiola. Permita que cada camundongo se recupere totalmente da anestesia antes de adicionar mais camundongos à gaiola.
nota: Os camundongos são recuperados quando retomam as atividades normais e não apresentam sinais de letargia ou movimento prejudicado.
- Avalie o estado de saúde dos camundongos diariamente durante o experimento após o transplante. Se os enxertos formarem uma grande protuberância ou os camundongos ficarem fracos e letárgicos, meça a glicose no sangue e forneça 10% (p / p) de água de sacarose ad libitum a todos os camundongos hipoglicêmicos. Siga todas as recomendações veterinárias e eutanasiar todos os camundongos com má condição corporal contínua de acordo com as diretrizes institucionais. Neste estudo, os camundongos foram eutanasiados por inalação de CO2 seguida de luxação cervical.
4. Isolamento e purificação de esplenócitos autorreativos
- Identifique camundongos NOD machos ou fêmeas de 10 a 16 semanas de idade com diabetes de início recente (menos de 10 dias) usando tiras de teste de glicose na urina (ou no sangue). Os camundongos NOD são considerados diabéticos quando apresentam urina/glicemia ≥250 mg/dL em pelo menos 2 dias consecutivos.
nota: Para cada camundongo NOD-scid, são necessários 10 milhões de esplenócitos; Um baço normalmente produz de 50 milhões a 150 milhões de esplenócitos. Os esplenócitos foram isolados de camundongos livres de patógenos alojados em uma instalação monitorada por sentinais.
- Eutanasiar o número apropriado de camundongos NOD diabéticos.
nota: Neste estudo, os camundongos foram eutanasiados por inalação de CO2 seguida de luxação cervical para garantir a morte.
- Com o mouse de costas, faça uma incisão vertical de aproximadamente 2 polegadas de comprimento na pele com uma tesoura cirúrgica. Abra o lado direito do mouse do ponto de vista do pesquisador e localize o baço vermelho brilhante. Corte suavemente o baço do pâncreas rosado e transfira-o para uma placa de Petri estéril de 10 cm contendo 5 mL de PBS estéril. Repita a dissecção com quantos camundongos forem necessários.
nota: Baços de vários camundongos podem ser combinados em um prato. Execute as etapas a seguir usando reagentes e equipamentos estéreis em um capuz estéril.
- Amasse o(s) baço(s) com a parte superior plana de um êmbolo de seringa estéril.
- Coloque um filtro de 40 μm ou 70 μm em um tubo cônico de 50 mL e lave o filtro com 5 mL de PBS para escorvar. Transfira a suspensão do baço para o filtro e continue a triturar suavemente o filtro. Lave o prato com 10 mL de PBS e transfira a lavagem para a peneira. Continue amassando até que a cor vermelha desapareça da peneira.
- Descarte o filtro e gire o tubo a 500 × g por 5 min em RT. Remova o sobrenadante com uma pipeta de aspiração.
- Ressuspenda o pellet celular em 5 mL (para até três baços) de tampão de lise ACK pré-aquecido a RT e lise os glóbulos vermelhos por 4 min. Aumente o volume em 1-2 mL por baço se forem necessários baços adicionais.
- Pare a reação com 5 mL de meio celular NIT-1 (descrito acima) por 5 mL de tampão de lise. Passe a suspensão celular por uma peneira nova para remover grumos. Descarte a peneira e gire a 500 × g por 5 min em RT.
- Ressuspenda o pellet celular em 20 mL de PBS e conte as células. Gire a 500 × g por 5 min em RT. Ressuspenda as células em PBS estéril a uma concentração de 1 × 108 células / mL (o volume de injeção é de 0,1 mL / camundongo) em um tubo de reação de trava segura de 1,5 mL.
- Conservar as células no gelo (durante não mais de 1 h) ou mantê-las em RT e proceder imediatamente à injecção da veia da cauda.
5. Injeção intravenosa de esplenócitos diabéticos através da veia lateral da cauda
- Aqueça o corpo dos camundongos NOD-scid receptores adultos (por exemplo, usando uma lâmpada de calor por ~ 5-10 min) para vasodilatar as veias (isso ajuda na visualização e injeção na veia).
nota: Para evitar o superaquecimento dos mouses, não exceda esse tempo. Sempre monitore o status de integridade. Se os ratos parecerem exaustos ou imóveis, desligue a lâmpada de calor imediatamente.
- Aqueça a suspensão celular. Prepare uma seringa estéril (0,3-1,0 mL) com uma agulha estéril (27-30 G, 0,3 mm/0,5 pol ou menor) ou use uma seringa estéril de insulina de 0,5 mL com uma agulha de 0,3 mm (0,5 pol). Mantenha sempre a agulha estéril e utilize um tabuleiro estéril se a seringa tiver de ser colocada entre as injeções.
- Ressuspenda a solução de esplenócitos antes de cada injeção. Para cada camundongo, aspire 100 μL da suspensão de esplenócitos pré-aquecida e misturada para a seringa. Certifique-se de que não haja bolhas de ar na seringa ou na suspensão.
nota: Certifique-se de ter todos os equipamentos e suprimentos preparados (lenços umedecidos com álcool para desinfecção, uma seringa carregada com os esplenócitos a serem injetados e uma gaiola nova para separar os camundongos injetados) antes de colocar o mouse no dispositivo de contenção.
- Coloque o mouse no dispositivo de retenção. Capture a cauda com a mão não dominante e localize uma das duas veias laterais da cauda. Gire suavemente a cauda, se necessário. Limpe a cauda com um lenço desinfetante (álcool isopropílico 70%) para limpar a pele e aumentar a visibilidade da veia.
- Insira a agulha em um ângulo agudo na região central da cauda com a mão dominante. Com o chanfro da agulha voltado para cima, deslize a agulha alguns milímetros pela pele.
nota: Certifique-se de que a agulha esteja paralela à veia e colocada ligeiramente sob a pele. Esteja preparado para movimentos bruscos do camundongo / cauda logo após penetrar na parede da pele / vaso. Uma inserção bem-sucedida da agulha deve parecer um "deslizamento suave" na veia. Se outra tentativa for necessária, mova-se mais para cima na cauda em direção ao corpo.
- Aplique uma leve pressão na seringa para injetar a suspensão de esplenócitos. Não permita que a agulha se mova mais para dentro ou para fora durante a injeção. As injeções bem-sucedidas são suaves sem sentir qualquer contrapressão durante a injeção e são indicadas por um fluxo sanguíneo transparente/branco imediatamente após a injeção.
- Solte suavemente a agulha para fora da veia e aplique uma leve pressão na cauda com um pano de desinfecção até que o sangramento pare. Solte o mouse do dispositivo de contenção e transfira-o suavemente para uma gaiola recém-preparada.
nota: Injete dois a três camundongos de controle que não recebem um transplante de células NIT-1 com esplenócitos para confirmar o potencial dos esplenócitos autorreativos para induzir diabetes, o que leva aproximadamente 2-4 semanas após a injeção.
6. Imagem bioluminescente in vivo de enxertos NIT-1
NOTA: Fotografe os enxertos uma a duas vezes por semana. No dia do transplante, espere pelo menos 2 h após o transplante para permitir que os enxertos se assentem e garantam a expressão estável da luciferase. Se o tempo for um fator limitante, a medição inicial pode ser feita no Dia 1. Um cronograma de imagem inicial recomendado é o Dia 0 ou Dia 1 após a injeção, Dia 5, Dia 10, Dia 14, Dia 18 e Dia 25. Ajuste o cronograma, no entanto, com base no progresso da autoimunidade, conforme julgado pela perda de sinal bioluminescente.
- Prepare uma solução de D-luciferina a 15 mg/ml em PBS de Dulbecco. Agite em RT para dissolver e filtro estéril (0,22 μm). Armazene alíquotas de 1 mL a -20 °C e descongele conforme necessário.
nota: As alíquotas podem ser congeladas novamente.
- Pelo menos 5 minutos antes da imagem, injete os camundongos por via intraperitoneal usando uma seringa de 1 mL e uma agulha de 26 G com solução de D-luciferina na dose de 150 mg / kg.
nota: Use uma seringa e uma agulha novas para cada mouse.
- Anestesiar os camundongos por inalação de isoflurano de acordo com as diretrizes institucionais. As condições recomendadas são isoflurano a 2,5% com uma taxa de fluxo de 1,5 L/min na câmara de desativação e uma taxa de evacuação de 9 L/min.
- Lubrifique os olhos do animal com pomada oftálmica para evitar o ressecamento.
- Abra o software associado ao instrumento de imagem. Crie um novo usuário e/ou login. No painel de controle no canto inferior direito, selecione Inicializar (Figura 1A). Para salvar automaticamente os dados de imagem, crie as pastas apropriadas no computador e selecione Aquisição | Salvar automaticamente em... (Figura 1A). Quando o instrumento terminar de inicializar, defina o tempo de exposição para 1 min.
nota: Os parâmetros completos de imagem são mostrados na Figura 1B.
- Transfira os camundongos um de cada vez da câmara de desativação para o instrumento de imagem. Coloque o rato de bruços com os membros abertos e guie suavemente a cabeça para o cone do nariz. Uma taxa de fluxo de isoflurano de 0.25 L/min administrada por meio de um cone nasal é apropriada para manter a anestesia durante a imagem. Alise suavemente o mouse pressionando o centro das costas com as duas mãos e, em seguida, espalhando as mãos para fora e para fora.
- Selecione Adquirir (Figura 1B). Registre todos os detalhes relevantes do experimento na janela pop-up (Figura 1C).
nota: Veja a Figura 2A para imagens representativas de três camundongos NOD-scid fêmeas de 8 semanas transplantados com dois enxertos em vários pontos de tempo.
