Imunização intradérmica com esporozoítos vivos atenuados em modelo de camundongo

Resumo

Fonte: Mac-Daniel, L., et al. Isolamento de células mielóides da pele de camundongo e linfonodo de drenagem após imunização intradérmica com esporozoítos de Plasmodium atenuados vivos. J. Vis. Exp. (2016).

Este vídeo demonstra um ensaio para imunizar um modelo de camundongo com esporozoítos vivos atenuados. Os esporozoítos de Plasmodium atenuados por radiação são injetados no lado dorsal da orelha do camundongo. Após injeções em vários locais em ambas as orelhas, o camundongo pode se recuperar.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Materiais e reagentes

1. Use mosquitos Anopheles stephensi fêmeas (cepa Sda500) que se alimentam de camundongos infectados 3-5 dias após a emergência e criam conforme descrito anteriormente.
2. Utilizar parasitas Plasmodium berghei clone ANKA que expressam o gene da Proteína Fluorescente Verde (GFP) sob o controle do promotor constitutivo da Proteína de Choque Térmico 70 (HSP70). Isso produz fluorescência brilhante ao longo do ciclo de vida do parasita.
3. Use camundongos C57BL/6JRj fêmeas (7 semanas de idade).
   nota: Todos os reagentes utilizados no protocolo descrito estão listados na Table of Materials/Equipment.

2. Isolamento de esporozoíto atenuado por radiação das glândulas salivares do mosquito

1. Entre 18 e 25 dias após a refeição de sangue infeccioso, colete e anestesie os mosquitos a frio em um tubo de 15 ml no gelo, conforme descrito anteriormente. Transfira-os cuidadosamente para uma placa de Petri invertendo o tubo. Mantenha os insetos no gelo e exponha os mosquitos a uma dose de 12 krad de irradiação γ ou x.
2. Isole esporozoítos atenuados das glândulas salivares do mosquito irradiadas, conforme descrito anteriormente. Colete as glândulas salivares infectadas em um pequeno volume (cerca de 15 μl) de 1x solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS) no gelo e esmague-as suavemente para liberar esporozoítos.
   nota: Sendo crítica a injeção de uma suspensão de parasita altamente concentrada em um pequeno volume, portanto, é essencial colher um número suficiente de glândulas salivares de um grande número de mosquitos bem infectados pré-selecionados, como evidenciado por sua expressão robusta de fluorescência verde.
3. Filtrar a suspensão de esporozoítos através de uma tampa de filtro de células de 35 μm adaptada a um tubo de microcentrífuga de baixa adesão de 1,5 ml, a fim de eliminar aglomerados e detritos de mosquitos.
4. Conte o número total de esporozoítos isolados conforme descrito anteriormente e ajuste a concentração de suspensão do parasita com 1x DPBS frio para obter 83.000 esporozoítos/μl. Armazene os parasitas no gelo enquanto continua as próximas etapas.
5. Coletar o número equivalente de glândulas salivares de mosquitos não infectados que serão usados como controle negativo e processar a amostra conforme descrito nas etapas 2.2 e 2.3. Diluir a amostra conforme indicado acima para obter concentração semelhante de extratos de glândulas salivares na suspensão.
   nota: Os esporozoítos podem ser armazenados no gelo por no máximo 2 horas. No entanto, idealmente, eles são injetados dentro de uma hora após o esmagamento das glândulas salivares.

3. Injeção de esporozoítos na camada dérmica da orelha

1. Anestesiar os animais por injeção intraperitoneal da mistura de cetamina (50 mg/kg)/xilazina (5 mg/kg). Aguarde de 5 a 8 minutos para que o camundongo fique em estado de inconsciência e aplique pomada oftálmica nos olhos para evitar o ressecamento da córnea. Avalie a profundidade da anestesia realizando uma pinça suave em ambos os pés traseiros.
   nota: A dose de anestesia dura menos de 20 min, portanto, os próximos passos devem ser feitos rapidamente.
2. Estabilize o pavilhão auricular do camundongo fixando o lado ventral com fita adesiva transparente previamente colocada sob um estereomicroscópio (Figura 1A). Pressione suavemente a orelha para evitar danos à vasculatura.
3. Carregue uma seringa de 10 μl / agulha chanfrada de calibre 35 com 0,6 μl de parasitas ressuspensos.
4. Administre a suspensão de esporozoítos em 4 locais de injeção (0,15 μl por local) inserindo cuidadosamente a agulha no lado dorsal da orelha (Figura 1A), abaixo da epiderme, com o chanfro para cima, tomando cuidado para evitar vasos sanguíneos. Deixe a agulha permanecer na derme por alguns segundos para evitar o refluxo do injetante antes de removê-lo. Observe uma pápula característica em cada local de injeção no final do procedimento (Figura 1B e 1C).
5. Após a injeção, remova cuidadosamente a orelha da fita.
6. Injete na orelha contralateral a mesma dose de parasitas seguindo os passos 3.2-3.4.
7. Injete 2 camundongos adicionais com 0,6 μl de 1x DPBS ou 0,6 μl de 1x DPBS + extrato de glândula salivar de mosquitos não infectados para avaliar a resposta inflamatória mediada apenas pela injeção e a deposição de material de mosquito na derme.
8. Monitore a recuperação do camundongo da anestesia antes de colocá-lo de volta na gaiola.
   nota: A deposição adequada de esporozoítos na pele pode ser monitorada por microscopia de fluorescência (Figura 2A e 2B), sendo o camundongo preparado conforme descrito anteriormente.

Resultados

Figura 1: Injeção intradérmica de esporozoítos na orelha do camundongo. (A) Imagem mostrando injeção intradérmica de esporozoítos no pavilhão auricular de um camundongo anestesiado. O lado ventral da orelha é estabilizado com fita transparente previamente colocada sob um microscópio de dissecação. A agulha é cuidadosamente inserida no lado dorsal da orelha, abaixo da...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Cetamina: Imalgene® 1000	Merial	-	-
Xilazina: Rompun® 2%	Bayer	-	-
Seringa NanoFil + agulha de calibre 35	Instrumentos de precisão mundiais	-	-
Seringa de insulina Omnican® 50 0,5 ml/50 U.I.	B. Braun Medical	9151125	-
Placa de cultura de tecidos de 6 poços MultiwellTM – Fundo plano	Falcão BD	353046	-
Filtro de células de 70 μm	Falcão BD	Rolamento 352350	-
Seringa de 2 ml	Terumo	SS-02S	-
Tubo cônico de polipropileno BLUE MAXTM 15ml	Falcão BD	352097	-
Tubo cônico de polipropileno BLUE MAXTM 50ml	Falcão BD	352098	-
Tubo de fundo redondo de poliestireno de 5 ml com tampa de filtro de célula de 35μm	Falcão BD	352235	-
DPBS 1X Cacl2- e MgCl2 - livre	Tecnologias da Vida	14190-094	-
DMEM 1X + GlutaMAXTM	Tecnologias da Vida	Rolamento 31966-021	-
Desoxirribonuclease I do pâncreas bovino, tipo IV	Sigma-Aldrich	D5025	50 μg/ml
Camundongos C57BL/6JRj fêmeas (7 semanas de idade)	Laboratórios Janvier	-	-