1. Cultura de iPSCs humanas (hiPSCs) em fibroblastos embrionários de camundongos (MEF)
NOTA: Métodos alternativos para cultura de hiPSCs também podem ser usados, incluindo, mas não se limitando à semeadura em uma placa de 6 poços pré-revestida com gelatina, uma mistura de proteínas gelatinosas, laminina recombinante 511 ou qualquer outra matriz extracelular usada na expansão de hiPSC e cultivada usando meios definidos especialmente formulados para cultura de células-tronco pluripotentes humanas.
- Cultura de MEF
- Cubra uma placa de Petri de cultura de células de 10 cm com 4 mL de gelatina a 0,1% e incube por 30 min a 37 ° C.
- Descongele rapidamente um frasco de MEF irradiado 4 x 106 em 10 mL de meio MEF a 37 ° C (Dulbecco's Modified Eagle Medium [DMEM] + 10% de soro fetal bovino (FBS) + 1x penicilina-estreptomicina + 1x suplemento de L-glutamina). Centrifugue a 300 x g durante 5 min a 4 °C. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 9 ml de meio MEF.
- Remova o prato revestido de gelatina da incubadora. Aspire a gelatina e adicione 7 mL de meio MEF. Coloque 3 mL de suspensão de MEF (da etapa 1.1.2) no prato revestido de gelatina. Balance o prato de um lado para o outro e da frente para trás para garantir uma distribuição uniforme do MEF sobre o prato. Incubar a 37 °C durante 8-36 h.
- Passando hiPSC em MEF
NOTA: Os dados foram gerados usando o antígeno de melanoma reconhecido pelas células T 1 (MART-1) iPSC derivado de linfócito infiltrante de tumor de melanoma cultivado a longo prazo (TIL), que reconhece especificamente o peptídeo MART-1 no contexto do antígeno leucocitário humano (HLA)-A*02:01.
- HiPSCs de passagem quando as colônias têm entre 0,8 - 1,2 mm de diâmetro. Antes de passar, verificar as colónias de hiPSC num microscópio estereoscópico e remover quaisquer áreas de diferenciação da cultura utilizando a extremidade plástica de uma ponta de 200 μL.
- Aspire o meio gasto e adicione 10 mL de meio hiPSC (meio de cultura de células-tronco embrionárias humanas [ES] [Tabela de Materiais] + 10 ng/mL de fator de crescimento de fibroblastos básicos humanos [hbFGF]) suplementado com 10 μM de inibidor de proteína quinase associada a Rho (ROCK).
- Segure a placa de cultura de células com uma mão e role uma ferramenta descartável de passagem de células por toda a placa em uma direção. Aplique pressão suficiente para que toda a lâmina do rolo toque na placa de cultura e mantenha a pressão uniforme durante a ação de rolamento.
- Girar a placa de cultura a 90° e repetir o passo 1.2.3. Veja a placa no microscópio para confirmar visualmente o corte adequado das colônias, que devem aparecer quadriculadas. Separar as colônias cortadas por lavagem mecânica suave usando uma pipeta de 200 μL.
nota: O desprendimento das colônias cortadas por lavagem mecânica deve ser feito imediatamente após o corte das colônias com o rolo, pois após 3 min, as colônias cortadas começarão a se reconectar ao prato e será difícil destacar as colônias de tamanho homogêneo por lavagem.
- Transfira 350 - 600 aglomerados de colônias cortadas para um novo prato de 10 cm de MEF (plaqueado 8 - 36 h antes da passagem do hiPSC) com 10 mL de meio hiPSC fresco suplementado com inibidor de ROCK de 10 μM. Incubar a 37 °C.
NOTA: 600 aglomerados representam aproximadamente 1,0 x 106 MART-1 iPSC e produzirão 0,5-1,0 x 106 células DP no dia 35. No entanto, os números esperados variam dependendo da potência da linha celular inicial e das condições de cultura.
- No dia seguinte, aspire os meios gastos e adicione 10 mL de meios hiPSC frescos. Troque a mídia hiPSC a cada 1-2 dias, dependendo da taxa de crescimento do hiPSC.
2. Preparação de células OP9/DLL1 para co-cultura com hiPSCs
- Cultura de células OP9/DLL1 em meio OP9 [meio essencial mínimo de α (α-MEM) + 20% de soro fetal bovino (FBS) + 1x penicilina-estreptomicina] a 37 °C. Quando as células OP9 / DLL1 atingirem a confluência, aspire o meio e lave uma vez com 5 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) sem magnésio, cálcio e fenol.
- Aspire PBS e adicione 2 mL de ácido tripsina-etilenodiaminotetracético (EDTA) a 0,05%. Incubar durante 5 min a 37 °C. Em seguida, adicione 4 mL de meio OP9 e dissocie mecanicamente a camada celular pipetando para fazer uma suspensão unicelular.
- Transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 50 mL através de um filtro de células de 100 μm para evitar aglomerados de células. Centrifugar a 300 x g durante 5 min a 4 °C. Aspirar o sobrenadante e ressuspender em 12 ml de meio OP9.
- Adicione 8 mL de meio OP9 a seis novas placas de Petri de cultura de células de 10 cm. Coloque 2 mL de suspensão de célula OP9/DLL1 da etapa 2.3 em cada novo prato de 10 cm. Balance o prato de um lado para o outro e depois da frente para trás para garantir uma distribuição uniforme de OP9/DLL1 sobre o prato.
- Incubar a 37 °C. Repetir a passagem a cada 2 a 3 dias quando as células atingirem a confluência.
nota: É importante fazer estoque congelado suficiente de células OP9 / DLL1 e descongelar um novo estoque a cada 4-6 semanas.
3. Diferenciação in vitro de hiPSCs em células T CD8αβ+ Single Positive (SP)
- Prepare pratos OP9 / DLL1 gelatinizados uma semana antes da co-cultura com hiPSCs. Para preparar a solução de gelatina a 0,1%, adicione 5 mL de solução de gelatina estoque de grau de tecido em temperatura ambiente (RT) a 500 mL de PBS.
- Cubra 3 novas placas de Petri de cultura de células de 10 cm adicionando 4 mL por placa de gelatina a 0,1%. Incubar 30 min a 37 °C.
- Aspire a gelatina e adicione 8 mL de meio OP9 a cada prato. Passe uma placa confluente de OP9/DLL1 (como feito na seção 2 acima) para três placas pré-revestidas de gelatina.
- Após 4 dias, adicione 10 mL de meio OP9 a cada prato de 10 cm de OP9 / DLL1 na gelatina para 20 mL de meio por prato.
- Após 7 a 8 dias, inicie a co-cultura de hiPSC em placas confluentes OP9 / DLL1 (dia de diferenciação 0).
- Aspirar meios gastos de prato confluente de 10 cm de hiPSCs em MEF. Adicione 10 mL de mídia OP9. Corte e retire as colônias de hiPSC usando uma ferramenta descartável de passagem de células, conforme feito nas etapas 1.2.3 e 1.2.4.
- Transfira 350 - 600 aglomerados de colônias cortadas para um prato OP9 / DLL1 pré-gelatinizado de 10 cm (etapa 3.1) com 10 mL de meio OP9 fresco usando uma pipeta de 200 μL. Balance o prato de cultura de um lado para o outro e depois da frente para trás para garantir uma distribuição uniforme das colônias.
nota: Em alternativa, podem ser utilizados corpos embrióides hiPSC pré-formados (EB) ou suspensão de pequenas aglomerados. No entanto, o uso de uma ferramenta de passagem celular descartável ou sistema de formação de EB é preferível para produzir aglomerados de hiPSC de tamanho uniforme.
- No dia 1, aspire o meio gasto e substitua-o por 20 mL de meio OP9 fresco. aglomerados de hiPSC co-cultivados em OP9 / DLL1 por 1 dia aparecerão como pequenas colônias redondas de monocamada (Figura 1).
- No dia 5, aspire 10 mL de meio gasto e adicione 10 mL de meio OP9 fresco. As colônias de hiPSC começarão a se diferenciar em mesoderma primitivo, caracterizado por um centro escuro de várias camadas.
- No dia 9, aspire 10 mL de meio gasto e adicione 10 mL de meio OP9 fresco. Nesse ponto, as estruturas centrais de várias camadas evoluirão para formas semelhantes a cúpulas, e uma área semelhante a uma rede periférica se tornará evidente.
- No dia 13, colha células progenitoras hematopoiéticas (HPCs) (Figura 1). As estruturas derivadas de hiPSC no dia 13 são caracterizadas por um organoide central escuro cercado por uma rede de áreas semelhantes a cúpulas, representativas de zonas hematopoiéticas (HZs) relatadas anteriormente para envolver progenitores hematopoiéticos derivados de células-tronco embrionárias humanas.
NOTA: A presença de estruturas em forma de cúpula indica um processo bem-sucedido mesmo na ausência de centros escuros. A incapacidade de produzir HPCs pode ser devido à baixa qualidade de OP9 / DLL1, qualidade do lote FBS, confluência de aglomerados de iPSC semeados em OP9 / DLL1 (350-600 aglomerados é o ideal) e / ou variações na potência das linhas de iPSC para produzir precursores hematopoiéticos.
- Aspire o meio gasto e lave 1x com 5 mL de 1x solução salina balanceada Hanks sem vermelho de fenol modificada com cálcio e magnésio (HBSS).
- Aspire HBSS e adicione 250 μL de 5000 unidades / mL de colagenase IV em 10 mL de HBSS. Incubar a 37 °C durante 45 min. Aspire HBSS com colagenase IV e lave uma vez com 5 mL de PBS.
- Aspire PBS e adicione 5 mL de tripsina-EDTA a 0,25%. Incubar a 37 °C durante 20 min. Em seguida, adicione 4 mL de meio OP9 e dissocie a camada celular pipetando para fazer uma suspensão unicelular.
- Transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 50 mL através de um filtro de células de 100 μm. Centrifugue a 300 x g durante 5 min a 4 °C. Aspirar o sobrenadante e ressuspender em 10 ml de meio OP9.
- Suspensão das células da placa numa nova placa de Petri gelatinizada de 10 cm para cultura de células (ver passos 3.1.1 e 3.1.2). Incubar a 37 °C durante 45 min. Em seguida, colete as células não aderentes por pipetagem suave.
- Transfira a suspensão celular coletada para um tubo cônico de 50 mL através de um filtro de células de 100 μm. Centrifugue a 300 x g por 5 min a 4 °C. Aspire o sobrenadante e ressuspenda em 10 mL de meio de diferenciação [meio OP9 com 5 ng/mL de fator de células-tronco humanas (hSCF), 5 ng/mL de ligante Flt3 humano (hFLT3L) e 5 ng/mL de interleucina humana 7 (hIL-7)].
- Coloque a suspensão da célula em um novo prato confluente OP9/DLL1 de 10 cm.
- No dia 16, passe as células.
- Separe mecanicamente as células não aderentes por pipetagem suave e filtre através de um filtro de células de 100 μm. Centrifugar a 300 x g durante 5 min a 4 °C. Aspirar o sobrenadante e ressuspender em 10 ml de meios de diferenciação.
- Coloque a suspensão da célula em um novo prato confluente OP9/DLL1 de 10 cm.
- Continue passando as células não aderentes a cada 5-7 dias depois disso, repetindo a etapa 3.8.
- No dia 35, enriqueça a população CD4 + CD8 + duplo positivo (DP) e estimule a produção de células T CD8αβ + single positive (SP) (Figura 2).
- Separe mecanicamente as células não aderentes pipetando e filtrando suavemente através de um filtro de células de 100 μm para remover aglomerados. Enriqueça a população de células CD4+ pelo isolamento de esferas magnéticas CD4 de acordo com o protocolo do fabricante.
nota: A justificativa para o uso de esferas magnéticas CD4 é remover as células CD4-CD8- duplo negativo (DN) da cultura, pois foi demonstrado que elas causam a morte direta de células CD4 + CD8 + DP após a estimulação.
- Conte as células vivas enriquecidas com CD4 usando um hemocitômetro Neubauer e corante azul de tripano. Suspender em meio OP9 a uma concentração total de 0,5 x 106 células/mL. Alíquota de 1 mL da suspensão celular (0,5 x 106 células) em cada poço de uma cultura de tecidos de fundo plano 24 placas saudáveis de OP9/DLL1 confluente.
- Adicione 100 UI de interleucina humana 2 (hIL-2), 5 ng/mL de hIL-7, 500 ng/mL de anticorpo CD3 humano e 2 μg/mL de anticorpo anti-CD28 humano e, em seguida, cultura a 37 °C.
