Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.
1. Preparando pratos alimentadores de células glia (2 semanas antes do dia da cultura)
- Disseque o córtex de um cérebro de camundongo pós-natal de 1 dia de idade e retire as meninges.
- Pique o tecido do córtex o mais finamente possível com uma tesoura limpa em uma placa de Petri limpa em uma bancada limpa.
- Transfira o tecido picado para 12 mL de HBSS e adicione 1,5 mL de tripsina a 2,5% e DNase a 1% (peso / vol). Incubar em banho-maria a 37 °C durante 15 min, balançar de 5 em 5 min. O tecido bem digerido torna-se pegajoso e forma um grande aglomerado. Triturar 10-15 vezes com uma pipeta de 10 mL para quebrar o tecido e obter uma melhor digestão.
- Triturar o tecido bem digerido 10-15 vezes com uma pipeta de 5 mL até que a maioria dos pedaços desapareça e o meio fique turvo. Passe por um filtro de células para remover os pedaços restantes e adicione 15 mL de meio glia (meio essencial mínimo (MEM) suplementado com glicose (0,6% em peso/vol), 10% (vol/vol) de soro de cavalo e Penicilina-Estreptomicina (1x) para interromper a digestão.
- Centrifugar as células a 120 x g durante 5 minutos e aspirar o sobrenadante. Ressuspenda o pellet celular com meio glia fresco e semeie em placas de cultura celular (cerca de 105 células / cm2).
- Substitua o meio por meio de glia fresco no dia seguinte para remover as células soltas.
- Alimente os pratos de glia a cada 3-4 dias com meio de glia fresco. Bata no frasco 5 a 10 vezes com a mão para desalojar as células frouxamente presas antes de trocar de meio.
- Após 10 dias de cultura, as células gliais devem estar quase confluentes. Separe as células da glia com 0,25% de tripsina-EDTA e semeie cerca de 105 células em uma nova placa de cultura de células de 60 mm. As células restantes podem ser congeladas para uso futuro.
- 3 dias antes do dia da cultura, troque o meio da glia pelo meio de cultura neuronal (Meio Neurobasal-A com 1x GlutaMAX-I e 1x suplemento B27)
2. Cultura de neurônios do hipocampo
NOTA: Todas as etapas são executadas em temperatura ambiente.
- Dissecar 6-8 hipocampos de filhotes pós-natais de 1 dia de idade de camundongos ANK3-E22/23f/f com meio HBSS em uma placa de Petri em temperatura ambiente. Pique o hipocampo com uma tesoura de dissecação em pedaços menores. Transfira o hipocampo da placa de Petri para um tubo de 15 mL.
- Lave o hipocampo 2x com 5 mL de HBSS no tubo. Deixe o hipocampo em 4,5 mL de 1x HBSS após a lavagem.
- Adicione 0,5 mL de tripsina a 2,5% em 4,5 mL de HBSS e incube em banho-maria a 37 °C por 15 minutos. Inverta o tubo a cada 5 minutos. Hipocampos bem digeridos devem se tornar pegajosos e formar um aglomerado. Se necessário, prolongue a digestão por mais 5 minutos.
- Lave os hipocampos com HBSS 3 vezes por 5 minutos cada. Não use um aspirador para remover o HBSS. É muito fácil remover o hipocampo.
- Adicione 2 mL de HBSS após a lavagem e pipete o hipocampo para cima e para baixo com uma pipeta Pasteur 15 vezes.
- Triturar o tecido com uma pipeta Pasteur polida a fogo (o diâmetro da abertura é reduzido pela metade) 10 vezes. Não vá além de 10 vezes, mesmo que ainda haja pedaços restantes. O cisalhamento excessivo mata os neurônios.
- Descanse o tubo por 5 minutos até que todos os pedaços fiquem no fundo. Use suavemente uma ponta de pipeta de 1 mL para transferir o sobrenadante contendo os neurônios dissociados para placas de revestimento (105 células / placa de 60 mm). Adicione-o diretamente ao meio de revestimento pré-incubado e agite a placa suavemente.
- Repita as etapas 2.6-2.7 com os pedaços restantes até que a maioria dos pedaços tenha desaparecido.
- 2-4 horas após a semeadura, verifique as placas de revestimento com um microscópio de luz. A maioria dos neurônios deve ter se ligado à lamínula. As células anexadas são redondas e brilhantes. Vire as lamínulas usando uma pinça de ponta fina para os pratos alimentadores de células da glia com meio de cultura neuronal pré-condicionado com o lado dos pontos de cera voltado para baixo.
- Os neurônios podem crescer nos pratos de alimentação de células da glia por até 1 mês. Alimente os neurônios a cada 7 dias com 1 mL de meio de cultura neuronal fresco.
- Etapa opcional: 1 semana após a semeadura, adicione citosina arabinosídeo (1-β-D-arabinofuranosilcitosina) a uma concentração final de 5 μM para conter a proliferação glial.
