Gerando uma cultura de neurônios primários de baixa densidade a partir de neurônios embrionários congelados

Resumo

Fonte: Koganezawa, N. et al., Cultura primária de baixa densidade fácil e reprodutível usando estoque congelado de neurônios embrionários do hipocampo.J. Vis. Exp. (2023)

Este vídeo demonstra o método de cultura de neurônios embrionários criopreservados, envolvendo descongelamento controlado, diluição com meio neurobasal e semeadura em uma placa revestida de poli-L-lisina. A incubação subsequente suporta o crescimento e a manutenção das conexões neuronais.

Protocolo

Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.

1. Revestimento de placas

1. Cubra uma microplaca de 96 poços com poli-L-lisina (1 mg / mL, diluído em tampão borato 0,1 M [pH: 8,5]; 100 μL / poço) e incube durante a noite a 37 ° C.
   nota: Cubra apenas os poços que precisam ser usados. Nos experimentos realizados aqui, os 60 poços médios são usados. O tampão borato é preparado misturando ácido bórico 50 mM e borato 12 mM em água esterilizada.
2. Lave a placa duas vezes com água esterilizada (250 μL/poço).
3. Lave a placa uma vez com meio de cultura fresco sem suplementos (250 μL / poço).
4. Seque o prato em uma bancada limpa por 20 min.
5. Embrulhe o prato com papel alumínio e mantenha-o a 4 °C até o uso (válido por 1 mês).

2. Semeadura de células

1. Adicionar 50 μL/alvéolo do meio de cultura à placa revestida e mantê-lo numa incubadora a 37 °C, 5% CO₂ durante 30 min a 1 h. Encher os alvéolos periféricos com água esterilizada (200 μL/alvéolo).
   nota: O meio de cultura é preparado adicionando 50x B-27, 400x Glutamax e 100 U/mL de penicilina/estreptomicina ao meio neurobasal (consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes).
2. Remova o neurônio criovial do tanque de nitrogênio líquido. Os neurônios usados aqui eram neurônios criopreservados com dimetilsulfóxido (DMSO-criopreservados).
3. Mergulhe o criogênico em um bloco de calor a 37 ° C por até 3 min e descongele parcialmente o conteúdo. Não aqueça o criogenio por muito tempo. Transfira o conteúdo para um tubo de 50 mL assim que for descongelado.
4. Transfira lentamente o conteúdo criovial do neurônio para um tubo estéril de 50 mL gota a gota (50 μL / s) usando uma pipeta de 1 mL com uma ponta de poro largo.
5. Enxágue o criogenial vazio com 1 mL do meio de cultura (temperatura ambiente; RT). Transfira este 1 ml do meio de cultura do gota a gota criovícola (50 μL/s) para o tubo de 50 ml que contém a suspensão celular.
6. Adicionar 9 ml do meio de cultura (RT) ao tubo de 50 ml gota a gota (0,5 ml/s) e completar o volume para 11 ml. Não repita a pipetagem, mas misture a suspensão celular lentamente.
7. Conte o número de células (use um contador de células ou um hemocitômetro).
8. Transfira toda a suspensão celular para um reservatório e dispense a suspensão celular para a placa de 96 poços usando uma pipeta multicanal com pontas de poros largos (1,0 x 10⁴ células/poço). Para reduzir a evaporação do meio de cultura, encha os poços periféricos com água esterilizada (etapa 2.1).
   nota: Este estudo confirma que a evaporação do meio de cultura é pequena para uma cultura de 3 semanas sem troca de meio. A taxa de redução do meio é de 3,6% (n = 120 poços). Assim, a mudança de osmolalidade não será drástica durante o período de incubação de 3 semanas.
9. Incubar os neurônios por 1-2 h em uma incubadora de CO₂ a 37 °C, 5%.
10. Substitua o meio de cultura por 100 μL de meio de cultura pré-aquecido (37 °C) por alvéolo e coloque-o de volta em uma incubadora de CO₂ a 37 °C e 5% (nenhuma troca de meio é necessária durante a cultura).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placa de 96 poços	Corporação Zeon		dotado
Placa de 96 poços	Greiner	655986
B-27	Gibco	Rolamento 17504-044	2 v/v% para placas MEA; 50x para placas normais
bórax	sigma	B-9876	Concentração final 12 mM
ácido bórico	WAKO	Telefone: 021-02195	Concentração final 50 mM
Albumina de soro bovino	Millipore	12659-100G	Concentração final: 3% em PBS
GlutaMAX	Gibco	Rolamento 35050-061	2,5 mM para placas MEA; 400x para placas normais
Analisador de células 2200	Cytiva		Imagens de fluorescência
Neurobasal	Gibco	Rolamento 21103-049
Penicilina/estreptomicina	Gibco	15140-122	100 U/mL para placas normais
Penicilina/estreptomicina	nacalai tesque	Rolamento 26253-84	100 μg/mL para placas MEA
Poli-L-lisina	sigma	Pág. 2636	Diluído no tampão borato (concentração final: 1 mg/ml)
Neurônio do céu	AlzMed, Inc.	ARH001	1,0 x 106 células/tubo