Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.
1. Revestimento de lamínulas de vidro com poli-L-lisina
- Preparar lamínulas de vidro descongelando uma alíquota de 5 ml de solução de poli-L-lisina (PLL) de 200 μg/ml. Dilua esta solução estoque para 20 μg / mL adicionando 45 mL de água pura para injeção. Filtre a solução em um novo tubo cônico de 50 mL. Rotule este tubo como "PLL Estéril".
nota: Use água armazenada em temperatura ambiente para acelerar o processo de descongelamento.
- Adicione 100 lamínulas de vidro estéreis, redondas e de 12 mm à solução PLL estéril. Agite o tubo a cada 5 a 10 minutos, por 2 a 3 minutos, para garantir um revestimento uniforme. Cubra as lamínulas desta forma por 1 h.
nota: As lamínulas de vidro redondas de fabricação alemã (diâmetro = 12 mm) são preferidas, pois fornecem uma superfície de cultura confiável e se encaixam facilmente nos poços de uma placa de cultura de células de 24 poços.
- Após 40 min de revestimento PLL, pegue 2 pedaços de papel de seda e coloque-os no gabinete de fluxo. Esterilize o papel com etanol a 70%, alise para remover os vincos e deixe secar.
- Depois de revestir as lamínulas de vidro por 1 h com PLL, remova o excesso de solução de PLL e adicione água estéril de grau de injeção. Agite suavemente as lamínulas por 2–3 s para permitir a remoção do excesso de PLL. Repita esta etapa de enxágue mais 2 vezes.
- Remova o excesso de água e transfira as lamínulas para o lenço de papel estéril. Separe cuidadosamente cada lamínula usando uma pinça curva e deixe secar.
nota: As lamínulas que não se separam facilmente podem ser descartadas. Alternativamente, uma pequena quantidade de água pode ser adicionada para ajudar na separação.
- Depois de secos, transfira as lamínulas para uma placa de cultura de 24 poços.
nota: As lamínulas devem ser preparadas aproximadamente 30 minutos a 1 h antes de iniciar o processo de dissecação. As placas podem ser armazenadas em uma incubadora a 37 °C e 5% de CO2 até que sejam necessárias.
2. Dissociação do hipocampo e do tecido cortical
- Preparação de soluções de cultura celular
- Para a dissociação do tecido neural, primeiro descongelar uma alíquota de 40 mL de tampão de cultura celular (composição [em mM]: 116 NaCl, 5,4 KCl, 26 NaHCO3, 1,3 NaH2PO4, 1 MgSO4·7H2O, 1 CaCl2·2H2O, 0,5 EDTA·2Na·2H2O e 25 D-glicose, pH = 7,4). Meça 12 mL de tampão de cultura de células para um tubo cônico de 15 mL; rótulo como "BSA". Meça 5 mL de tampão de cultura de células para um tubo diferente de 15 mL; rótulo como "papaína". Incubar ambos os tubos em banho-maria durante 15 min a 37 °C.
- Filtre o tampão de cultura de células restante, rotule como "Tampão - Estéril" e armazene a 4 °C até que seja necessário.
- Pese 120 mg de albumina de soro bovino (BSA) e adicione ao tubo rotulado como "BSA". Pese 7 mg de papaína e adicione ao tubo rotulado como "papaína". Retorne os dois tubos ao banho-maria por 15 min.
nota: É útil adicionar uma pequena quantidade de tampão ao barco de pesagem para facilitar a transferência do pó de papaína.
- Depois que todos os pós estiverem dissolvidos, filtre e esterilize cada solução para um novo tubo cônico de 15 mL. Para papaína em tubo, rotule a solução filtrada como "papaína - estéril". Para o tubo BSA, divida a solução estéril de BSA em 3 tubos, cada um contendo 4 mL de solução BSA. Rotule cada tubo como "BSA - Estéril" e "1", "2" ou "3". Retorne todos os tubos de volta ao banho-maria e continue a incubar a 37 °C até que seja necessário.
- Preparação para dissecção de tecidos
- Pegue uma única folha de papel de filtro de 35 mm (ver Tabela de Materiais) e esterilize com etanol a 70%; deixe secar na tampa de uma placa de Petri de 100 mm, em um armário de fluxo. Disponha a tesoura, fórceps, bisturi e espátula (ver Tabela de Materiais) necessários para a dissecção do hipocampo e do córtex.
- Coloque duas placas de Petri de 35 mm e uma placa de Petri de 100 mm contendo papel de filtro estéril em um local acessível no centro do gabinete de fluxo.
- Colete NexCre transgênico; Filhotes de camundongos Ai9 e VGAT Venus que devem ser dissecados. Use uma lâmpada fluorescente com filtros de excitação e emissão apropriados (consulte a Tabela de Materiais) para discriminar filhotes fluorescentes de irmãos de ninhada do tipo selvagem.
- Imediatamente antes da dissecação dos animais, encher cada placa de Petri de 35 mm com tampão de cultura de células estéril refrigerado.
nota: Uma placa de Petri é para limpar as ferramentas entre as dissecações e a outra é para coletar o hipocampo e o córtex.
- Dissecção tecidual
- Assim que o tampão de cultura de células for derramado, decapite um filhote de camundongo ou rato transgênico do dia 0–2 pós-natal usando uma tesoura grande e afiada e use uma placa de Petri estéril de 100 mm para transferir a cabeça para o gabinete de fluxo. Use fórceps, tesoura e uma espátula para transferir cuidadosamente o cérebro de um filhote transgênico para papel de filtro estéril.
- Use um bisturi tipo 22 para dissecar o cerebelo e separar os 2 hemisférios. Use uma pequena espátula para rolar os hemisférios lateralmente. Em cada hemisfério, pressione suavemente para que o córtex entre em contato com o papel de filtro. Mova suavemente as regiões do mesencéfalo para revelar o hipocampo e o córtex.
nota: Tenha cuidado para não aplicar muita pressão ao pressionar os hemisférios ou as células podem ser esmagadas.
- Use um bisturi ou espátula para separar o hipocampo e o córtex de cada hemisfério. Transferir o tecido dissecado para uma placa de Petri de 35 mm contendo tampão de cultura de células resfriada.
nota: Se dissecar vários animais, armazene o tampão de cultura de células estéreis em um tubo cônico de 50 mL no gelo. Após cada dissecção, transfira o tecido dissecado para o tampão de cultura de células resfriado.
- Após a dissecção bem-sucedida do tecido córtico-hipocampal, transfira a solução estéril de papaína do banho-maria para o gabinete de fluxo. Use uma pipeta Pasteur de 3 mL para transferir o hipocampo e o córtex dissecados para a tampa de uma placa de Petri estéril de 35 mm. Pique em movimentos cruzados, usando a parte plana de um bisturi tipo 22, até que o tecido esteja em pedaços pequenos.
- Use uma pequena quantidade de solução de papaína para transferir o tecido picado da tampa da placa de Petri para o tubo de papaína estéril. Retorne o tubo de papaína ao banho-maria e incube o tecido a 37 °C por 25 min.
- Durante a incubação da papaína, faça uma solução completa de meio de fluorescência. Descongele uma alíquota de 1 mL de B27, uma alíquota de 0,5 mL de Glutamax e uma alíquota de 0,5 mL de Pen-Strep. Alíquota 48,5 mL de Hibernate Um meio de baixa fluorescência para um tubo cônico de 50 mL. Adicione B27, Glutamax e Pen-Strep à solução. Agite bem a solução, depois filtre e rotule como "Hibernate A complete media" (com data e iniciais). Incubar a 37 °C em banho-maria.
- Após a incubação da papaína, transfira o tubo de papaína e os tubos BSA estéreis para o gabinete de fluxo. Use uma pipeta de Pasteur de 1 mL para remover apenas o tecido cortico-hipocampal do tubo de papaína para o tubo BSA 1.
nota: Tome cuidado para minimizar a transferência de excesso de solução de papaína.
- Dissociação de células
- Para quebrar quaisquer grandes aglomerados de tecido, triture o tecido várias vezes usando uma pipeta Pasteur de 1 mL. Em seguida, triture o tecido 7 vezes usando uma pipeta Pasteur de ponta fina. Deixe o tecido repousar por 30 s, permitindo que pedaços maiores de tecido se sedimentem.
- Após 30 s, transfira o 1 mL inferior de solução e tecido do tubo BSA 1 para o tubo BSA 2. Triturar o tecido no tubo BSA 2 várias vezes usando uma pipeta Pasteur de ponta fina.
- Após a trituração, transfira novamente o 1 mL inferior de tecido e solução do tubo BSA 1, mas agora para o tubo BSA 3. Triturar o tecido no tubo BSA 3 várias vezes usando uma pipeta de Pasteur de ponta fina.
- Após a trituração, transfira toda a solução e tecido dos tubos 2 e 3 para o tubo BSA 1. Triturar mais 2-3 vezes e centrifugar a 3.000 x g por 3 min.
- Durante a centrifugação, faça o meio Neural Basal A completo (meio NBA). Alíquota de 48,5 mL de meio NBA para um tubo cônico de 50 mL e incubar a 37 °C em banho-maria. Rotule este tubo como "apenas NBA". Além disso, descongele uma alíquota de 1 mL de B27, uma alíquota de 0,5 mL de Glutamax e uma alíquota de 0,5 mL de Pen-Strep à temperatura ambiente.
- Após a centrifugação, remova cuidadosamente o sobrenadante do tecido peletizado e ressuspenda as células em 2 mL de meio completo. Use uma pipeta P1000 para triturar o tecido para cima e para baixo 20 vezes.
nota: Tome cuidado para não pipetar as células com muita força. Se muita pressão for aplicada, as células podem ser danificadas.
- Use uma pipeta Pasteur de 1 mL para filtrar a suspensão celular através de uma peneira de células de 30 μm em um tubo de amostra de poliestireno.
nota: Se a suspensão celular não passar imediatamente pela peneira celular, pode ser necessário pressionar a parte superior da peneira com uma luva estéril para iniciar o fluxo. Esta etapa importante evita o entupimento do classificador de células.
- Para coletar neurônios após a classificação, prepare os tubos de coleta pipetando 300 μL de meio completo para o número necessário de tubos de polipropileno.
- A suspensão de células está agora pronta para ser levada ao classificador de células para triagem. Pegue a suspensão celular, tubos de coleta extras e meios completos sobressalentes caso seja necessária a diluição da amostra.
3. Classificação celular de neurônios GABAérgicos ou glutamatérgicos purificados
NOTA: Para minimizar a chance de contaminação bacteriana durante a classificação, lave o sample tubo do classificador com etanol a 70% por pelo menos 5 minutos antes da classificação. Os parâmetros de classificação detalhados variam entre os instrumentos, as considerações fundamentais são as seguintes.
- Durante a primeira classificação de células, estabeleça os níveis de fluorescência de fundo de células não marcadas, classificando e comparando células de um animal selvagem.
- Para cada tipo de célula fluorescente a ser classificado, escolha os filtros de excitação e emissão apropriados. Excite as proteínas Vênus e TdTomato usando comprimentos de onda de excitação de 488 nm ou 531 nm, respectivamente. Detecte a luz emitida através de conjuntos de filtros de emissão 530/40 e 575/30, respectivamente.
- Adicione tubos de coleta de polipropileno, contendo 300 μL de meio completo, ao classificador de células para coleta de células.
- Para alta pureza, classifique as células fluorescentes marcadas com cores vivas (consulte a Figura 1B para obter exemplos de gráficos de pontos de células classificadas).
- Após a classificação, para obter os melhores resultados, realize um teste de pureza das células classificadas para estimar os níveis de pureza. Observe que a taxa de recuperação típica das células após a classificação está entre 70 e 80%.
- Anote o número de células classificadas em cada tubo de coleta. Este valor é dado pelo instrumento de classificação de células.
nota: A classificação de células pode ser realizada usando um bico de 70 μm (pressão do fluido da bainha de 70 psi) ou um bico de 100 μm (pressão do fluido da bainha de 20 psi).
4. Cultura de neurônios classificados
- Após a classificação das células, transfira as células coletadas para tubos centrífugos de fundo redondo de 2 mL, usando uma pipeta Pasteur de 1 mL. Centrifugue as células a 3.000 x g por 3 min para formar um pellet de célula.
nota: Para ajudar a identificar a localização do pellet de célula, oriente os tubos de centrífuga de fundo redondo com a dobradiça da tampa voltada para fora, o que permite que o pellet de célula se forme na parte de trás do tubo de centrífuga (ou seja, no mesmo lado do tubo que a dobradiça).
- Durante a centrifugação, adicione 1 mL de B27, 0,5 mL de Glutamax e 0,5 mL de Pen-Strep aos 48,5 mL de meio NBA pré-aquecido. Agite bem a solução, depois filtre, esterilize e rotule como "mídia completa NBA" (com data e iniciais). Volte ao banho-maria até que seja necessário.
- Após a centrifugação, use uma pipeta Pasteur de 1 mL para transferir o sobrenadante para um tubo de centrífuga diferente (retenha o sobrenadante caso o pellet celular tenha sido perturbado). Ressuspenda o pellet celular na quantidade necessária de meio NBA completo pré-aquecido para atingir uma densidade celular de 1.000 células/μL. Ressuspenda as células pipetando para cima e para baixo com uma pipeta P200 ou P1000.
- Para confirmar a presença de células dissociadas, verifique a solução celular ao microscópio, usando uma lente objetiva de 4x ou 10x. Como alternativa, pipete uma pequena quantidade de solução celular em uma lamínula e verifique ao microscópio. Se estiver presente um grande número de células, o sobrenadante do passo 4.3 pode ser descartado.
- Antes de plaquear as células, vortex em velocidade média por 2–3 s para garantir uma suspensão celular uniforme. Após o vórtice, pipetar rapidamente 10 μL da suspensão celular para o centro de cada lamínula. Depois de pipetar as células, retorne rapidamente cada placa à incubadora (5% de CO2/37 °C) e incube por 1 h.
nota: Se adicionar células a várias placas de 24 poços, garanta densidades celulares uniformes fazendo vórtices entre as placas.
- Após 1 h, alimente as células com 500 μL de meio NBA completo pré-aquecido e retorne à incubadora.
nota: Ao alimentar as células, é importante pipetar o meio suavemente pela lateral do poço para evitar o descolamento da célula. Para experimentos curtos (<16 dias), não é necessária alimentação na densidade acima. Ao plaquear uma densidade maior de células, intervalos de alimentação mais frequentes podem ser necessários.
