Geração de progenitores neurais a partir de células-tronco embrionárias em culturas monocamada sem soro

Resumo

Fonte: Wongpaiboonwattana, W., et al. Diferenciação Neural de Células-Tronco Embrionárias de Camundongo em Cultura de Monocamada Sem Soro. J. Vis. Exp.(2015)

O vídeo demonstra um protocolo que usa mídia sem soro para gerar progenitores neurais a partir de células-tronco embrionárias de camundongos. A concentração desejada de células-tronco embrionárias, suspensas em meio sem soro, é revestida em lamínulas revestidas de gelatina. Em uma densidade celular ideal, as células produzem fatores de sinalização autócrinos, que, juntamente com os fatores indutores de diferenciação neural no meio livre de soro, desencadeiam a diferenciação de células-tronco embrionárias em progenitores neurais.

Protocolo

1. Preparação de mídia

NOTA: O protocolo baseia-se no uso de uma mistura de dois meios separados: DMEM/F12 suplementado com suplemento de N2 modificado e Neurobasal suplementado com suplemento de B27, normalmente em uma proporção de 1:1.

1. Prepare o suplemento de N2 modificado misturando os componentes em um tubo de 15 ml. Não vórtice ou filtre isso; Misturar invertendo o tubo até obter uma solução límpida.
   1. Comece pipetando 7,2 ml de DMEM/F12, depois adicione 1 ml de insulina 25 mg/ml (composta em HCl 0,01 M) e misture bem invertendo o tubo. Demora alguns minutos até que a solução esteja clara.
   2. Adicione 1 ml de 100 mg/ml de apo-transferrina (composta em água), 33 μl de 0,6 mg/ml de progeesternona (composta em etanol), 100 μl de putrescina 160 mg/ml (1 M) (composta em água), 10 μl de selenito de sódio 3 mM (composta em água) e 666 μl de albumina sérica bovina a 7,5% e misture bem o tubo. Alíquota em 2,5 ml e conservar a -20 °C durante um período máximo de 2 meses.
2. Prepare a mídia.
   1. A 250 ml de DMEM/F12, adicionar 2,5 ml de N2. Misture bem, mas não agite nem filtre.
   2. A 250 ml de meio neurobasal, adicione 5 ml de suplemento B27. Misture bem, mas não agite nem filtre.
   3. Misture a mídia das etapas 1.2.1 e 1.2.2 na proporção de 1:1. Em alguns casos, pode ser necessária uma mistura de 1:3 (complementada como a mistura de 1:1 na etapa 1.2.4).
   4. À mistura, adicione 0,5 ml de L-glutamina (concentração final de 0,2 mM) e 3,5 μl de 2-mercaptoetanol (concentração final de 0,1 mM) e misture bem sem agitar. Armazene a mídia a 4 °C por até 3 semanas e evite expor à luz. Essa mistura final é chamada de N2B27.
3. Prepare a solução de gelatina.
   1. Prepare uma solução de gelatina a 1% em água ultrapura e autoclave a 121 °C, 15 psi, por 15 min. É importante que o frasco usado para isso esteja completamente limpo de detergentes ou desinfetantes, por isso é recomendável que um novo frasco seja usado para isso e só seja enxaguado em água ultrapura entre os usos. Alíquota da solução a 1% em alíquotas de 50 ml e manter a 4 °C durante meses.
   2. Aqueça uma alíquota de gelatina a 1% em banho-maria a 37 °C até dissolver e adicione a 500 ml de solução salina tamponada com fosfato quente (PBS). Misture bem e pipete o suficiente para cobrir o fundo de cada poço ou placa. Deixe a gelatina revestir a superfície por pelo menos 30 min.

2. Revestimento das células

NOTA: Este protocolo se aplica igualmente a ESC de camundongo cultivado em soro a 10% com fator inibidor de leucemia (LIF), reposição de soro por LIF ou meio livre de soro com LIF e proteína morfogenética óssea 4 (BMP4) ou inibidores de MEK e GSK3 (meio 2i) com ou sem LIF. No entanto, o tempo e a eficiência da diferenciação podem variar dependendo do meio e das células. Para os experimentos mostrados aqui, usamos a linha ESC de camundongo 46C (com um repórter EGFP batido em um dos alelos endógenos de Sox1), cultivada em GMEM com 10% de soro e LIF. Para obter os melhores resultados, é importante que as células sejam dissociadas e replaqueadas no meio N2B27; a simples mudança de meio de GMEM/soro/LIF para N2B27 sempre resulta em uma eficiência de diferenciação reduzida em comparação com o rerevestimento das células.

1. Cultive as células em GMEM com 10% de soro, 1 mM de piruvato de sódio, 1x aminoácidos não essenciais, 0,1 M de 2-mercaptoetanol e 100 unidades/ml de LIF13. Para obter uma cultura subconfluente de ESC de camundongo, coloque 1 x 10⁶ células em um frasco de cultura T25, o que levará de 2 a 3 dias.
2. Observe as células sob um microscópio de campo claro. Quando as células estiverem subconfluentes e prontas para passar, enxágue-as duas vezes em PBS. Adicione 1 ml de reagente de dissociação celular e retorne à incubadora por 2 a 5 min. Embora a tripsina e outras enzimas também possam ser usadas para dissociação celular, elas podem afetar negativamente a ligação celular, portanto, as densidades de revestimento precisarão ser ajustadas.
3. Assim que as células começarem a se levantar da placa, bata no vaso para desalojá-las em uma única suspensão celular. Recolher as células em 10 ml de meio e de reagente de dissociação celular e pipetar para um tubo de centrifugação de 15 ml.
4. Gire as células a 300 x g por 3 min em RT.
5. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 10 ml de N2B27 pré-aquecido, pipetando 3 a 5 vezes para cima e para baixo. Ao pipetar a suspensão para baixo, pipete contra a lateral do tubo para evitar a criação de bolhas. Conte as células com um contador de células automatizado ou um hemocitômetro e registre a concentração.
6. Preparar uma suspensão celular contendo o número desejado de células por unidade de volume a ser semeada por alvéolo em N2B27 pré-aquecido. Uma densidade de 10.500 células por cm² em um prato de 6 poços (ou seja, 1 x 10⁵ células por poço de um prato de 6 poços) é ideal. Consulte a Tabela 1 para obter o número sugerido de células por cm² e volumes de meios de plaqueamento para vários vasos de cultura de células.
7. Aspirar a gelatina do recipiente de cultura e colocar a suspensão celular em placas de acordo com a densidade e o volume sugeridos no Quadro 1. Não gire as placas, pois isso concentrará as células no centro. Colocar as culturas numa incubadora húmida a 37 °C, 5% de CO₂.
8. Troque a mídia a cada 1 a 2 dias, substituindo toda a mídia por N2B27 nova. Pipetar suavemente, pois a lavagem das células pode afetar a densidade e diminuir a eficiência de diferenciação nos dias seguintes. Onde a viabilidade inicial após o plaqueamento for ruim, coloque as células em uma mistura de 1:3 do meio suplementado com N2 e B27 e mude para N2B27 após os primeiros dois dias. As células começarão a se diferenciar e devem mostrar a expressão de Sox1 (visível por fluorescência verde do repórter na linha celular 46C usada aqui) dentro de 4 a 6 dias.

Tabela 1. Densidades de revestimento e volumes de mídia sugeridos para diferentes tamanhos de recipientes. As densidades de plaqueamento nesta tabela foram determinadas usando a linhagem celular 46C. Para obter os melhores resultados, a densidade de revestimento de cada linha individual pode ter que ser ajustada.

plataforma	Faixa de densidade efetiva (células/cm2)	Faixa do número de células para a placa	Volume de mídia inicial sugerido (μl)	Volume de mídia sugerido após o dia 1 (μl)
Placa de 6 poços	10.500 - 36.500	99.750 - 346.750	1.000	2.000
Placa de 24 poços	15.600 - 46.800	29.640 - 88.920	500	1.000
Placa de 96 poços	103.500 - 260.000	33.120 - 83.200	100	200

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Soro fetal bovino	Tecnologias da Vida	10270-106
DMEM/F12	Tecnologias da Vida	11320-074
Meio neurobasal	Tecnologias da Vida	Rolamento 21103-049
Reagente de dissociação celular StemPro Accutase	Tecnologias da Vida	A11105-01
Suplemento B-27, sem soro	Tecnologias da Vida	Rolamento 17504-044
insulina	sigma	I6634	Reconstituir com HCl estéril 0,01M
Apo-transferrina	sigma	T1147	Reconstituir com água estéril
progesterona	sigma	Pág. 8783	Reconstituir com etanol
putrescina	sigma	Pág. 5780	Reconstituir com água estéril
Selenito de sódio	sigma	S5261	Reconstituir com água estéril
Albumina bovina fração V	Tecnologias da Vida	Rolamento 15260-037
L-Glutamina	Tecnologias da Vida	Rolamento 25030-081	Certifique-se de que está completamente dissolvido antes de usar, pois a glutamina geralmente é sedimentada
gelatina	sigma	G1890
Placa de cultura de tecidos de 6 poços	Thermo Científico	140675
Placa de cultura de tecidos de 24 poços	Thermo Científico	142475
Placa de cultura de tecidos de 96 poços	Thermo Científico	167008
GMEM	Tecnologias da Vida	Rolamento 11710-035
Soro fetal bovino	Tecnologias da Vida	10270-106
MEM Solução de aminoácidos não essenciais	Tecnologias da Vida	Rolamento 11140-050
Piruvato de sódio	Tecnologias da Vida	Rolamento 11360-070
2-mercaptoetanol	sigma	M7522
Balão de cultura de tecidos de 25cm2	Thermo Científico	156367