Diferenciando células-tronco neuronais humanas em cultura 3D usando um andaime poroso

Resumo

Fonte: Stevanato, L. et al., Diferenciação de uma linha de células-tronco neurais humanas em culturas tridimensionais, análise de microRNA e genes-alvo putativos. J. Vis. Exp. (2015)

Este vídeo mostra o desenvolvimento e a diferenciação de células-tronco neurais humanas dentro de um andaime tridimensional. Um revestimento de laminina no andaime promove a fixação celular, enquanto um meio neural livre de fator de crescimento induz a diferenciação celular em células progenitoras neurais, que estendem seus processos dentro de uma arquitetura porosa em várias direções, formando uma cultura tridimensional

Protocolo

1. Diferenciação do HNSC em Cultura Tridimensional (3D)

NOTA: Isole e derive células-tronco neurais humanas (hNSCs) de um tecido eticamente aprovado descrito em uma publicação anterior. Siga as diretrizes éticas e institucionais ao seguir este procedimento.

1. Cultura 3D usando placa de 12 poços
   1. Use uma técnica asséptica durante todo o procedimento. Em um gabinete de segurança biológica, reidrate os andaimes adicionando 2 ml/poço de etanol a 70% preparado com água para irrigação (WFIr). Evite tocar nos andaimes dispensando o etanol a 70% na parede de cada poço.
   2. Aspire cuidadosamente o etanol a 70% e lave imediatamente os andaimes com 2 ml/poço Dulbecco's Modified Eagle Medium F12 (DMEM: F12) por 1 min. Repita o procedimento de lavagem duas vezes. Aspire cuidadosamente o DMEM: F12 após a lavagem final.
   3. Cubra os andaimes adicionando 2 ml/alvéolo de laminina (10 μg/ml) em DMEM: F12. Incubar a placa a 37 °C em uma incubadora umidificada com 5% de CO₂ por um período mínimo de 2 horas. Lave a placa com DMEM quente: F12.
   4. Semeie cada andaime com aproximadamente 500.000 hNSCs em um volume de 150 μl de RMM+fatores de crescimento (GFs).
   5. Incube a placa por 3 horas a 37 ° C em uma incubadora umidificada com 5% de CO₂ para permitir que as células se depositem nos andaimes.
   6. Adicione 3,5 ml de RMM a cada poço, tomando cuidado para não desalojar as células dos andaimes.
   7. Incubar a placa durante 7 dias; substituir o meio RMM (3,5 ml/alvéolo) após 1 dia (primeira alimentação) e novamente após 2-3 dias a contar da primeira alimentação.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
DMEM: F12	Invitrogen	Rolamento 21331-020	Para preparação de meio RMM
Solução de albumina humana	Baxter cuidados de saúde limitada	1501052	Para o meio RMM usado em uma concentração final de 0,03%
Transferrina Recombinante Humana	sigma	T8158	Para o meio RMM utilizado numa concentração final de 5 μg/ml
Putrescina DiHCl	sigma	Pág. 5780	Para o meio RMM utilizado numa concentração final de 16,2 μg/ml
Insulina humana recombinante	sigma	I9278	Para o meio RMM utilizado numa concentração final de 5 μg/ml
progesterona	sigma	Pág. 6149	Para o meio RMM utilizado numa concentração final de 60 ng/ml
L-Glutamina	Invitrogen	Rolamento 25030-24	Para o meio RMM utilizado numa concentração final de 2 mM
Selenita de sódio	sigma	S9133	Para o meio RMM utilizado numa concentração final de 40 ng/ml
bFGF	Peprotech	AF-100-15	Para ser adicionado ao meio RMM, usado em uma concentração final de 10 ng / ml
FEG	Peprotech	AF-100-188	Para ser adicionado ao meio RMM, usado a uma concentração final de 20 ng/ml
4-OHT	sigma	H7904	Para ser adicionado ao meio RMM, usado em uma concentração final de 100 nM
Laminina	AMS Biotecnologia	3400-010-10
Água para irrigação	Baxter Saúde	UKF7114
Placa de 12 poços Alvetex	Reinnervate Ltd	AVP002
etanol	Merck	1.00986.1000