Geração de neurônios simpáticos pós-ganglionares a partir de células-tronco pluripotentes humanas

Resumo

Fonte: Wu, H. F., et al. Diferenciação eficiente de neurônios simpáticos pós-ganglionares usando células-tronco pluripotentes humanas sob condições de cultura sem alimentador e quimicamente definidas. J. Vis. Exp. (2020).

Este vídeo demonstra um método in vitro para gerar neurônios simpáticos pós-ganglionares a partir de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs). As hPSCs são diferenciadas em células da crista neural (NCCs) em um suporte de matriz de membrana basal usando um meio de diferenciação. Os NCCs são então dissociados e formados em esferóides usando outro meio de diferenciação. Finalmente, os esferóides são transformados em neurônios simpáticos pós-ganglionares usando um meio de neurônio simpático.

Protocolo

1. Configuração para revestimento de pratos, preparação de meios e manutenção de hPSC

1. Revestimento de louça
   1. Revestimento de vitronectina (VTN)
      1. Colocar os frascos para injetáveis de VTN num banho-maria a 37 °C até descongelarem completamente e, em seguida, misturar bem.
      2. Para uma placa de Petri de 100 mm, misture 7 mL de solução salina tamponada com fosfato 1x (PBS) com 0,5 mg / mL de VTN, adicione a solução de VTN à placa e incube em temperatura ambiente (RT) por 1 h.
   2. Revestimento de matriz de membrana basal
      1. Descongele os frascos da matriz da membrana basal (ver Tabela de Materiais) em gelo a 4 ° C durante a noite.
      2. Para um poço de uma placa de 6 poços, misture 2 mL de Dulbecco's Modified Eagle Medium / Nutrient Mixture F-12 (DMEM / F12) com 20 μL de matriz de membrana basal 100x, adicione solução de matriz de membrana basal ao prato, embrulhe o prato com filme de parafina e armazene em um recipiente limpo a 4 ° C durante a noite. Trabalhe o mais rápido possível. Os pratos revestidos podem ser armazenados a 4 °C por até 2 semanas.
   3. Revestimento de poliornitina (PO)/laminina (LM)/fibronectina (FN)
      1. No primeiro dia, para um poço de uma placa de 24 poços, misture 15 μg/mL de PO com 1 mL de 1x PBS, incube a 37 °C, 5% de CO₂ durante a noite. Descongele o LM e o FN a -20 °C durante a noite e guarde a 4 °C até que estejam totalmente descongelados.
      2. No segundo dia, aspirar a solução de PO, lavar os poços 2x com 1x PBS, adicionar 1 mL de 1x PBS contendo 2 μg/mL de LM e 2 μg/mL de FN e incubar a 37 °C em 5% de CO₂ durante a noite. Neste ponto, o prato com a solução LM/FN pode ser mantido na incubadora por meses, desde que não seque. Adicione mais 1x PBS para evitar que o prato seque.
2. Preparação de mídia
   1. Prepare o meio Essential 8 (E8) descongelando um frasco de suplemento E8 a 4 °C durante a noite. Misture o suplemento com 500 mL de meio E8 e antibióticos, se necessário.
      nota: A solução E8 de trabalho deve ser usada dentro de 2 semanas.
   2. Prepare o meio de congelamento hPSC misturando 90 mL de meio E8 completo com 10 mL de dimetilsulfóxido (DMSO) para um volume total de 100 mL. Esterilize por filtro.
   3. Prepare o meio de diferenciação do dia 0 ao dia 1 misturando 100 mL de meio essencial 6 (E6) com 10 μM SB431542, 1 ng/mL de proteína morfogenética óssea 4 (BMP4), 300 nM CHIR99021 e 10 μM Y27632 para um volume total de 100 mL.
   4. Prepare o meio de diferenciação do dia 2 ao dia 10 misturando 100 mL de meio E6 com 10 μM SB e 0,75 μM CHIR99021 para um volume total de 100 mL.
   5. Prepare o meio esferóide do dia 10 ao dia 14 misturando meio neurobasal com 2 mL de B27 (50x), 1 mL de N2 (100x), 2 mM de L-glutamato, 3 μM de CHIR99021 e 10 ng/mL de fator de crescimento de fibroblastos-2 (FGF2) para um volume total de 100 mL.
   6. Prepare o meio do dia 14 ao dia 28 para manutenção do esferóide a longo prazo, adicionando 0,5 μM de ácido retinóico fresco (RA) ao meio esferóide do dia 10 ao dia 14 para cada alimentação.
      nota: Mantenha sempre a AR a -80 °C.
   7. Prepare o meio de maturação SymN misturando meio neurobasal com 2 mL de B27 (50x), 1 mL de N2 (100x), 2 mM de L-glutamato, 25 ng/mL de fator neurotrófico derivado da linhagem de células gliais (GDNF), 25 ng/mL de fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), 25 ng/mL de fator de crescimento nervoso (NGF), 200 μM de ácido ascórbico e 0,2 mM de monofosfato de adenosina dibutiril-cíclico (dbcAMP) para um volume total de 100 mL. A solução deve ser utilizada no prazo de 2 semanas. Antes de cada alimentação, adicione 0,125 μM de RA fresco. Esta solução é utilizada a partir do dia 14 (opção 1) ou do dia 28 (opção 2).
   8. Prepare o tampão de classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) misturando DMEM com 2% de FBS, 2 mM de L-glutamato e antibióticos, se necessário, para um volume total de 100 mL.
3. Manutenção de hPSC
   1. Descongelamento e manutenção de hPSCs
      1. Preparar uma placa de 100 mm revestida com VTN.
      2. Para descongelar um frasco de hPSCs diretamente do nitrogênio líquido, coloque o frasco em banho-maria a 37 ° C, balançando cuidadosamente o tubo na água até descongelar. Transfira os hPSCs descongelados para um tubo de 15 mL contendo 10 mL de 1x PBS e centrifugue a 200 x g por 4 min.
      3. Descarte o sobrenadante e adicione 1 mL de meio E8 ao tubo. Pipete algumas vezes para ressuspender totalmente o pellet e, em seguida, adicione mais 9 mL de meio E8 para atingir 10 mL no total.
      4. Aspirar a solução VTN da cápsula de 100 mm.
      5. Transferir os hPSCs para uma cápsula de 100 mm, agitar suavemente (de cima para baixo e da esquerda para a direita, não em círculos) para se certificar de que as células estão distribuídas uniformemente na placa
      6. Incubar a 37 °C, em 5% de CO₂.
      7. No dia seguinte, aspirar todo o meio e alimentar com 10 mL de E8.
      8. Alimente-se dessa maneira todos os dias pelos próximos 3 a 4 dias e depois prepare-se para dividir.
   2. Divisão de hPSCs
      NOTA: as hPSCs no ponto de divisão devem ser 80% a 90% confluentes. Grandes colônias com bordas lisas e brilhantes devem ser observadas. No entanto, o contato entre cada colônia deve ser evitado (Figura 1B, dia 0 e Figura 4B).
      1. Prepare pratos de 100 mm revestidos com VTN conforme necessário.
      2. Aspire o E8 e lave o prato que precisa ser dividido 1x com 1x PBS.
      3. Aspire o 1x PBS e adicione 4 mL de EDTA 0,25 M. Incubar por 2 min a 37 °C, 5% CO₂.
         nota: As hPSCs devem ser divididas/replaqueadas como pequenas colônias. Não trate com ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) por mais de 2 min para evitar a separação em células únicas. As células devem estar ainda presas à superfície da placa após o tratamento de 2 minutos.
      4. Aspire o EDTA, separe as colônias pipetando fortemente 10 mL de meio E8 na superfície do prato e colete todo o meio e células em um tubo de 15 mL.
      5. Com hPSCs em 80% a 90% de confluência, divida as colônias em 1:15-1:20. Por exemplo, para dividir as hPSCs em 1:20 em um prato de 100 mm, pegue 500 μL de solução de E8/hPSCs e misture com 9,5 mL de meio E8 fresco.
      6. Placas hPSCs em pratos de 100 mm revestidos com VTN.
         nota: É aconselhável estabelecer a proporção de divisão ideal para cada pesquisador e linhagem celular de forma independente.
   3. Congelamento de hPSCs
      1. Para uma placa de 100 mm de hPSCs pronta para ser dividida, prepare três criogeniais e 3,5 mL de meio de congelamento.
         NOTA: Os meios e frascos devem ser mantidos a 4 °C ou congelados até à utilização.
      2. Aspire E8 e lave o prato 2x com 1x PBS.
      3. Aspire 1x PBS e adicione 4 mL de EDTA 0,25 M, incube por 2 min a 37 °C, em CO 5%₂,
         NOTA: os hPSCs devem ser congelados como pequenas colônias no momento em que seriam divididos. Não trate as células com EDTA por mais de 2 minutos para evitar a separação em células únicas. As células ainda devem estar presas na superfície do prato após o tratamento de 2 minutos.
      4. Aspire o EDTA, separe as colônias pipetando fortemente 10 mL de 1x PBS na superfície do prato e colete todo o meio e células em um tubo de 50 mL.
      5. Adicione 20 mL de 1x PBS e centrifugue a 200 x g por 4 min para lavar o EDTA restante.
      6. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 3 ml de meio de congelação.
      7. Distribua hPSCs uniformemente nos três criogeniais, 1 mL cada.
      8. Armazene a -80 ° C durante a noite em uma caixa de congelamento controlado ou em um sanduíche de isopor para garantir uma queda lenta de temperatura e, em seguida, transfira para um tanque de nitrogênio líquido para armazenamento de longo prazo.

2. Semeando hPSCs para iniciar a diferenciação (dia 0)

NOTA: As hPSCs devem estar prontas para diferenciação após serem estabilizadas (ou seja, divididas 2 a 3x após o descongelamento). Certifique-se de que as colônias estejam saudáveis, com bordas lisas e brilhantes e diferenciação mínima (Figura 2B).

1. Prepare pratos revestidos com matriz de membrana basal (pratos de 24 ou 6 poços) um dia antes do dia 0, conforme necessário. Traga os pratos para RT no início da diferenciação.
2. Faça do dia 0–1 um meio de diferenciação conforme necessário.
3. Aspire o E8 do confluente, pronto para dividir hPCSs, e lave o prato 2x com 1x PBS.
4. Adicionar 7 ml de EDTA 0,25 M por placa de 100 mm, incubar a 37 °C, 5% de CO₂, durante 15 min.
   nota: Neste ponto, o tratamento com EDTA é prolongado para se dispersar em células únicas.
5. Retire todos os hPSCs (eles devem estar flutuando) e transfira para um tubo de 50 mL. Adicione a mesma quantidade ou mais de 1x PBS como solução de EDTA para diluir o EDTA.
6. Centrifugue a 200 x g por 4 min.
7. Descarte o sobrenadante, adicione 1 mL de meio de diferenciação dia 0–1 e pipete para homogeneizar as células. Em seguida, adicione mais meio e, em seguida, misture para diluir a solução celular até uma concentração ideal para contar as células.
   nota: Não dilua demais a solução celular. As células de uma placa cheia de 100 mm devem ser diluídas em 5 mL de meio para começar.
8. Conte o número de células usando um contador de células automatizado ou hemocitômetro.
9. Dilua a solução celular conforme necessário para atingir 125.000 células/^cm2 em um volume final baixo (por exemplo, 2 mL por alvéolo para um prato de 6 poços ou 500 μL por poço para um prato de 24 poços).
   nota: Um volume baixo ajuda as células a se ligarem mais rapidamente.
10. Aspire toda a solução de matriz da membrana basal dos pratos revestidos e coloque a solução celular nos poços.
11. Incubar a 37 °C, em 5% de CO₂.

3. Indução de células da crista neural (dia 1 ao dia 10, Figura 1A)

1. No dia 1, alimente as células com o meio de diferenciação do dia 0–1 (3 mL por poço para pratos de 6 poços e 1 mL por poço para pratos de 24 poços).
2. No dia 2, alimente as células com meio de diferenciação do dia 2 ao dia 10 (3 mL por poço para pratos de 6 poços e 1 mL por poço para pratos de 24 poços).
3. A partir de agora, as células devem ser alimentadas em dias alternados até o dia 10 (ou seja, o próximo dia de alimentação será o dia 4).
   nota: A partir do dia 6, as cristas NC devem ser detectadas (Figura 1B). Para verificar se a diferenciação está ocorrendo, é aconselhável realizar uma cultura de diferenciação paralela em poços menores (ou seja, 24 poços), que podem ser corados para SOX10 / AP2a e usados para expressão gênica de marcadores ao longo do tempo de diferenciação ( Figura 1B , C ).
4. Se estiver classificando células, vá para a seção 4. Caso contrário, prossiga para a seção 5.

4. Classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) para marcador de crista neural CD49D e agregação de células NC em esferoides

NOTA: Para a classificação FACS, as amostras devem ser mantidas no gelo e não devem ser expostas à luz após a coloração até a classificação.

1. Prepare o buffer FACS se as células estiverem classificadas.
2. Prepare o dia 10–14 esferóide médio.
3. No dia 10, remova o meio e lave 1x com 1x PBS.
4. Adicione a solução de dissociação (consulte a Tabela de Materiais) a 2 mL por poço para um prato de 6 poços ou 1 mL por poço para um prato de 24 poços e incube a 37 ° C, 5% de CO₂ por 20 min.
5. Pipetar todos os hPSCs e transferir para um tubo de 50 mL.
6. Encha o resto do tubo com tampão FACS e centrifugue a 200 x g por 4 min.
   nota: Cada tubo de 50 mL pode acomodar até 20 mL ou menos de solução celular. O volume do tampão FACS deve ser alto o suficiente para neutralizar a solução de dissociação.
7. Descarte o sobrenadante, ressuspenda as células com a quantidade apropriada de tampão FACS (~ 2 mL por poço de uma placa de 6 poços) e conte para determinar o número da célula.
8. Prepare as amostras a seguir.
   1. Amostra 1 (controle não corado): 1 x 10⁶ células em 400 μL de tampão FACS. Filtrar as células através de uma tampa de filtro de 20 μm e manter o tubo no gelo.
   2. Amostra 2 (controle somente DAPI): 1 x 10⁶ células em 400 μL de tampão FACS contendo 0,5 ug/mL 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). Filtre as células através de um tubo FACS com uma tampa de filtro e mantenha o tubo no gelo.
   3. Amostra 3 (marcada com CD49D): Suspenda o resto das células com tampão FACS contendo anticorpo CD49D conjugado com ficoeritrina/cianina7 (PE/Cy7) (5 μL para 1 x 106 células por 100 μL de tampão FACS) em um tubo de 15 mL e incube em gelo por 20 min.
9. Encha os tubos com tampão FACS e centrifugue a 200 x g por 4 min.
10. Descarte o sobrenadante e ressuspenda a cada 5–10 x 10⁶ células em 1 mL de tampão FACS contendo 0,5 ug/mL DAPI de acordo com as instruções do fabricante.
11. Filtre as células através do tubo FACS com a tampa do filtro e mantenha o tubo no gelo.
12. Prepare os tubos FACS de coleta contendo 2 mL de tampão FACS.
13. Classifique a máquina FACS com lasers que podem detectar DAPI e PE-Cy7 para isolar a população CD49D⁺.
14. Após a classificação, conte as células classificadas.
15. Centrifugue todas as células classificadas e ressuspenda no meio esferóide do dia 10–14 até uma concentração final de 0,5 x 10⁶ células por 500 μL de meio.
16. Placa 0,5 x 10⁶ células por poço em placas de 24 poços de fixação ultrabaixa.
17. Incubar as células a 37 °C, em 5% de CO₂.

5. Agregação de células NC em esferóides

1. Se não estiver usando o FACS para isolar as células NC e, em vez disso, agregá-las diretamente em esferoides, primeiro prepare as células conforme descrito nas etapas 4.2 a 4.5.
2. Encha o resto do tubo com 1x PBS e centrifugue a 200 x g por 4 min.
3. Descarte o sobrenadante, ressuspenda as células com uma quantidade apropriada de meio esferóide de dia 10–14 (por exemplo, ~ 2 mL de meio por poço para uma placa de 6 poços) e conte para determinar o número de células.
4. Dilua as células no meio esferóide do dia 10-14 para 0,5 x 10⁶ células por 500 μL de meio.
5. Placa de 500 μL da suspensão de células por poço em placas de 24 poços de fixação ultrabaixa.
6. Incubar as células a 37 °C, em 5% de CO₂.

6. Manutenção do esferóide NC e indução do progenitor simpático (dia 10 ao dia 14, Figura 3A)

1. Opção 1: cultura esferóide mínima
   1. No dia 11, adicione 500 μL de meio esferóide de dia 10–14 aos esferoides NC sem aspirar o meio existente a partir do dia 10. Incubar a 37 °C, em 5% de CO₂.
   2. No dia 12, incline a placa para acumular os esferoides NC em um lado dos poços. Aspire e descarte cuidadosamente o máximo de meio possível e alimente com 1 mL de meio esferóide do dia 10-14.
   3. Continue alimentando as células todos os dias até o dia 14.
   4. Opcional: Se os esferoides se agregarem e gerarem um aglomerado grande, use uma pipeta para quebrar os aglomerados de esferoides. Isso também garante que os esferoides individuais não fiquem muito grandes.
      nota: A faixa de tamanho ideal do esferóide deve ser em torno de 100–500 μm. Dentro desse intervalo, o tamanho dos esferoides individuais não é crítico. No entanto, a morfologia, como bordas lisas e claras (Figura 2 e Figura 4) é importante para um maior sucesso. No dia 14, cada placa de 24 poços contém idealmente cerca de 50 a 60 esferoides de tamanhos diferentes dentro da faixa de tamanho mencionada acima.
2. Opção 2: cultura esferóide expandida
   1. No dia 15, para manter os esferóides NC, alimente com 1,5 mL de meio esferóide do dia 10–14 contendo 0,5 μM RA. Incubar a 37 °C, 5% CO₂.
      nota: A AR deve ser adicionada fresca para cada mamada e sempre armazenada a -80 °C.
   2. A partir de agora, alimente em dias alternados até o dia 28 e continue com o plaqueamento dos esferoides (seção 7.1).
      nota: Os esferoides em crescimento são divididos aproximadamente 1x por semana, pipetando-os com uma pipeta de 1 mL para quebrá-los. Eles são divididos em uma proporção aproximada de 1:2–1:4. Dentro do período de expansão de 2 semanas, as células devem quadruplicar em número.

7. Diferenciação e maturação do neurônio simpático (SymN) (Opção 1: após o dia 14; Opção 2: após o dia 28)

1. Revestimento de esferóides em pratos regulares
   1. Prepare placas de 24 poços revestidas com PO / LM / FM.
   2. Prepare o meio symN contendo 0,125 μM RA (adicione fresco a cada alimento) e 10 μM Y27632 (somente dia 14).
   3. No dia 14, incline a placa para acumular esferoides NC em um lado dos poços. Aspire e descarte cuidadosamente o máximo de meio possível e alimente com 1 mL de meio symN.
   4. Remova LM/FN das placas revestidas.
   5. Divida e coloque cada poço da placa de 24 poços em 4 poços separados da nova placa de 24 poços revestida. Cada poço original terá 1 mL, contendo ~ 50-60 esferóides. Isso produz 250 μL, contendo aproximadamente 10 a 15 esferoides para cada poço na nova placa.
   6. Adicione 250 μL de meio adicional por poço.
      nota: Esta é uma divisão de 1:4; Certifique-se de que os esferoides estejam distribuídos adequadamente dentro da solução para que a divisão seja relativamente uniforme. O número de esferóides não é contado porque o número final não afeta o sucesso da geração de symNs.
   7. Incubar a 37 °C, 5% CO₂.
   8. No dia 15 (ou dia 29 para a opção 2), alimente substituindo todo o meio por 1 mL de meio symN contendo 0,125 μM RA. A partir de agora, os neurônios devem ser alimentados a cada 2 dias até o dia 20 (ou dia 35 para a opção 2).
   9. Após o dia 20 (ou dia 35 para a opção 2), os neurônios devem ser alimentados substituindo cuidadosamente apenas metade do meio existente (500 μL). De agora em diante, alimente todas as semanas, a menos que o meio fique amarelo rapidamente.
   10. Continue alimentando semanalmente até o momento desejado.
       NOTA: os symNs tendem a se agregar em estruturas semelhantes a gânglios e são propensos a se desprender das placas de cultura. Para evitar isso, recomenda-se meias mamadas e manuseio mínimo.

Resultados

Figura 1: Indução NC. (A) Linha do tempo e tratamentos para indução de NC do dia 0 ao dia 10. (B) A morfologia e a formação das cristas NC foram monitoradas a cada 2 dias por microscopia de campo claro. As células em cada ponto de tempo após o dia 2 foram coradas para AP2A (vermelho) e SOX10 (verde). Todas as imagens de imunofluorescência foram contracoradas com DAPI...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placas de cultura de células de 100 mm	falcão	353003
Tubos cônicos de cultura de tecidos de 15 mL	VWR/Corning	89039-664
Placas de cultura de tecidos de 24 poços	falcão	353047
Placas de fixação ultrabaixa de 24 poços	Corning	07 200 601 e 07 200 602
5% CO2/20% O2 incubadora de cultura de tecidos	Thermo Fisher/Tecnologias de Vida	Heracell VIOS 160i
Tubos cônicos de cultura de tecidos de 50 ml	VWR/Corning	89039-656
Placas de cultura de tecidos de 6 poços	Costar	3516
Accutase	Tecnologias de Célula de Inovação	AT104500	Solução de dissociação celular
Anticorpo anti-AP2a	Abcam	AB108311	Hospedeiro: Coelho; diluição 1:400
Anticorpo anti-Ascl1	BD Pharmingen	556604	Hospedeiro: IgG1 de camundongo; diluição 1:200
Anticorpo anti-CD49D	BioLegend	304313	Hospedeiro: IgG1 de camundongo; 5 μl/milhão de células em volume de 100 μl
Anticorpo anti-CD49D (isotipo)	BioLegend	400125	Hospedeiro: IgG1 de camundongo; 5 μl/milhão de células em volume de 100 μl
Anticorpo anti-DAPI	sigma	D9542	Diluição 1:1000
Anticorpo anti-DBH	Imunoestrela	22806	Hospedeiro: Coelho; diluição 1:500
Anticorpo anti-GFP	Abcam	AB13970	Hospedeiro: Frango; diluição 1:1000
Anticorpo anti-HOXC9	Santa Cruz Biotecnologia	SC-365692	Hospedeiro: Camundongo IgG1; diluição 1:100
Anticorpo anti-NET1	Mab	NET17-1	Hospedeiro: Mouse; diluição 1:1000
Anticorpo anti-PRPH	Santa Cruz Biotecnologia	SC-377093/H0112	Hospedeiro: Camundongo IgG2a; diluição 1:200
Anticorpo anti-SOX10	Abcam	AB50839	Hospedeiro: Mouse; diluição 1:100
Anticorpo anti-TH	Pel-Freez	Pág. 40101-150	Hospedeiro: Coelho; diluição 1:500
ácido ascórbico	sigma	A8960-5G	Concentração de estoque: 100 mM
Suplemento B27	Thermo Fisher/Tecnologias de Vida	Rolamento 12587-010	Concentração de estoque: 50x
BDNF	Sistemas de P&D	248-BD	Concentração de estoque: 10 μg/mL
BMP4	Sistemas de P&D	314-BP	Concentração de estoque: 6 mM
Contador de células	Thermo Fisher/Tecnologias de Vida	Condessa II
Lâminas de câmara de contagem de células	Invitrogen	C10312
centrifuga	Eppendorf	57021&5424R
CHIR99021	Sistemas de P&D	Rolamento 4423	Concentração de estoque: 6 mM
Crio-frasco	Thermo Fisher/Tecnologias de Vida	375353
dbcAMP	sigma	D0627	Concentração de estoque: 100 mM
DMEM	Thermo Fisher/Tecnologias de Vida	10829-018	Concentração de estoque: 1x
DMEM/F12	Thermo Fisher/Tecnologias de Vida	Rolamento 11330-057	Concentração de estoque: 1x
Dmso	Thermo Fisher/Tecnologias de Vida	BP231-100
E6 médio	gibco	A15165-01
E8 médio	gibco	A15169-01	Concentração de estoque: 1x
Suplemento E8	gibco	A15171-01	Concentração de estoque: 50x
Edta	sigma	ED2SS	Concentração de estoque: 0,5 M
Máquina FACS	Beckman Coulter	CytoFLEX (para FACS)
Máquina FACS	Beckman Coulter	MoFlo Astrios EQ (para classificação)
Tubos FACS (tampa do filtro azul)	falcão	352235
Tubos FACS (tampa branca)	falcão	352063
Soro fetal bovino (FBS)	Biológicos de Atlanta	S11150
GDNF	PeproTech	450	Concentração de estoque: 10 μg/mL
Geltrex	Invitrogen	A1413202	Matriz de membrana basal; Concentração de estoque: 100x
hPSCs	Thomson et al., (1998)	WA09
hPSCs	Oh et al. (2016)	H9-PHOX2B::eGFP
Fibronectina humana (FN)	VWR/Corning	Rolamento 47743-654	Concentração de estoque: 1 mg/mL
L-glutamina	Thermo Fisher/Gibco	Rolamento 25030-081	Concentração de estoque: 200 mM
Tanque LN	Sistemas biogênicos personalizados	V-1500AB
Laminina de rato I (LM)	Sistemas de P&D	3400-010-01	Concentração de estoque: 1 mg/mL
Suplemento N2	Thermo Fisher/Tecnologias de Vida	17502-048	Concentração de estoque: 100x
Meio neurobasal	gibco	Rolamento 21103-049	Concentração de estoque: 1x
NGF	PeproTech	450-01	Concentração de estoque: 25 μg/mL
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)	Gibco	14190-136	Concentração de estoque: 1x
Bromidrato de poli-L-ornitina (PO)	sigma	Pág. 3655	Concentração de estoque: 15 mg/mL
Primocin (antibióticos)	InvivoGen	ANTPM1	Concentração de estoque: 50 mg/mL
máquina de qPCR	Laboratórios Bio-Rad	Toque C1000
Placas de qPCR	Laboratórios Bio-Rad	HSP9601
FGF2 recombinante	Sistemas de P&D	233-FB/CF	Concentração de estoque: 10 μg/mL
Ácido retinóico	sigma	R2625	Concentração de estoque: 1 mM
SB431542	Tocris/Sistemas de P&D	1614	Concentração de estoque: 10 mM
Azul de tripano	Corning	MT-25-900-CI
Vitronectina (VTN)	Thermo Fisher/Tecnologias de Vida	Rolamento A14700	Concentração de estoque: 0,5 mg/mL
Banho-maria	VWR/Corning	706308
Y27632	Sistemas de P&D	1254	Concentração de estoque: 10 mM