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1. Preparativos
- Prepare 10 ml de meio de dissecção e adicione 200 μl de penicilina-estreptomicina 100x em 9,8 ml de Dulbecco's Modified Eagle Medium F12 (DMEM/F12).
- Preparar a solução de L-cisteína: a 10 ml de água para cultura de tecidos e adicionar 120 mg de L-cisteína. Conservar a solução de L-cisteína a 4 °C durante 2 semanas ou em alíquotas a -20 °C durante um período máximo de 1 ano.
- Preparar a solução de DNase I: adicionar 10 mg de DNase I a 1 ml de água para cultura de tecidos. Conservar a solução de DNase I a 4 °C durante um período máximo de 2 meses.
- Prepare a solução de papaína: para preparar a solução de papaína, adicione 100 μl de papaína (aproximadamente 140 unidades), 100 μl de DNase I (1%) e 200 μl de L-cisteína (12 mg / ml) em 5 mL de DMEM / F12. Preparar sempre a solução de papaína e esterilizar com um filtro de poros de 0,22 μm antes de utilizar.
- Prepare a solução de lavagem: para preparar 100 ml de solução de lavagem, adicione 650 μl de glicose 45%, 500 μL de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfônico, HEPES 1 M e 5 ml de soro fetal bovino (FBS) em 93,85 ml de solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS) 1x. Esterilize a solução de lavagem com um filtro de tamanho de poro de 0,22 μm antes de usar. Conservar a solução de lavagem a 4 °C durante um período máximo de 2 meses.
- Preparar solução de insulina: para preparar 2 ml de solução de insulina, adicionar uma gota de 25 μl de hidróxido de sódio (NaOH) 10 N e 100 mg de insulina em 2 ml de água para cultura de tecidos.
- Preparar soluções de fator de crescimento epidérmico (EGF) e fator de crescimento de fibroblastos (FGF): Dissolver ambos os mitógenos em DMEM/F12 na concentração de 100 μg/ml. Conservar em alíquotas de 10 μl a -20 °C.
- Preparar os meios B-27 e N-2: conservar os suplementos B-27 e N-2 a -20 °C sob a forma de alíquotas de 500 μl e 1 ml, respectivamente.
- Preparar meio de condição de diferenciação Z: para preparar 100 ml de meio de condição de diferenciação Z, adicionar 40 μl de insulina (50 mg/ml), 500 μl de B-27, 1 ml de N-2, 650 μl de glicose a 45% e 1 ml de 100 x penicilina-estreptomicina em 97,81 ml de DMEM/F12. Esterilize o meio de diferenciação Z com um filtro de tamanho de poro de 0,22 μm antes de usar. Conservar o meio de diferenciação Z a 4 °C durante 1 semana.
- Prepare o meio de condição Z: para preparar 50 ml de meio de condição Z, adicione 10 μl de EGF e 10 μl de FGF em 50 ml de meio estéril de condição de diferenciação Z (20 ng / ml). Conservar o meio de condição Z a 4 °C durante um período máximo de 1 semana.
- Prepare a solução de revestimento para cultura de diferenciação: para 5 ml de solução de revestimento extracelular, adicione 100 μl da solução de matriz extracelular (por exemplo, Matrigel) em 4,9 ml de DMEM/F12. Descongelar a solução de matriz extracelular a 4 °C no gelo. Depois de descongelado, manter a 4 °C por até 2 semanas.
2. Dissecção do cérebro do peixe-zebra adulto
- Prepare um leito de dissecação enchendo uma placa de Petri de 100 mm x 15 mm com bolsas de gelo em gel. Em seguida, coloque a tampa na placa de Petri e incube a -20 °C até que o gel congele. Em cima da tampa, coloque um quadrado de papel de filtro limpo e embrulhe o papel de filtro e a placa de Petri com filme plástico.
- Limpe e esterilize todos os instrumentos de microdissecção com etanol a 70% ou calor antes de cada uso. Coloque todos os instrumentos de dissecção esterilizados perto do microscópio de dissecação e, logo antes da eutanásia, coloque o leito de dissecção sob o microscópio com iluminação por fibra óptica.
- Colete 2 peixes-zebra adultos para uma preparação de neuroesferas cerebrais inteiras; e 3 a 4 peixes-zebra para gerar neuroesferas a partir de regiões cerebrais dissecadas.
- Eutanasiar peixe-zebra adulto (8-12 meses de idade) usando um protocolo aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais. Em seguida, mergulhe o peixe em etanol a 75% por 5-10 segundos e coloque rapidamente no leito de dissecação seguido de decapitação ao nível das brânquias usando uma lâmina cirúrgica.
- Para sacrificar animais, administre uma overdose (300 mg / L) de tricaína metano sulfonato até que os batimentos cardíacos do animal diminuam gradualmente e a circulação pare, depois mergulhe em água gelada.
- Vire a cabeça com o lado dorsal para baixo e, usando a tesoura, faça um corte longitudinal do lado cortado até a boca. Usando a pinça, exponha a base do crânio e remova todo o tecido adjacente. Corte as paredes laterais do crânio do início da medula espinhal em direção ao tectum.
- Usando a tesoura, corte e remova os nervos ópticos e, em seguida, remova os dois lados da parte mais lateral do crânio ao nível do tectum. Vire a cabeça com o lado ventral para cima. Usando uma pinça, retire o resto da parte mais apical do crânio.
- Transferir o cérebro juntamente com a parte restante do crânio para uma nova placa com o meio de dissecação (1.1). Limpe o tecido cerebral no meio de dissecção usando o cabo de plástico da microfaca, mantendo todas as estruturas cerebrais intactas.
- A partir deste ponto, continue o protocolo usando todo o cérebro do peixe-zebra.
- Alternativamente, adapte este protocolo a regiões cerebrais específicas para gerar neuroesferas de todo o cérebro do peixe-zebra ou do telencéfalo, tectum / diencéfalo ou cerebelo dissecado com um bisturi fresco. Use uma linha neural transgênica fluorescente específica do peixe-zebra para dissecar a região do cérebro de interesse de acordo com a Figura 1.
3. Dissociação de célula única do cérebro adulto
- Execute todo o trabalho subsequente em um gabinete de segurança biológica. Transferir o tecido cerebral para um tubo de 1,5 ml contendo 800 μl de meio de dissecção (preparado no passo 1.1). Remova o meio de dissecção por pipetagem, sem tocar no tecido cerebral.
- Adicionar 500 μl de solução de papaína (passo 1.4) e digerir o tecido cerebral a 37 °C durante 10 min. Não incube por mais de 15 minutos, pois isso pode diminuir a viabilidade celular.
- Após a incubação, transfira o tecido cerebral com 500 μl da solução de papaína para um tubo cônico de 15 ml usando uma ponta de pipeta de 1.000 μl cortada a ~ 0,25 polegadas do fundo. Dissocie suavemente o tecido cerebral pipetando lentamente para cima e para baixo 10 vezes com a mesma ponta. Não pipete para cima e para baixo mais de 15 vezes e não gere bolhas de ar durante esta etapa, pois isso pode alterar a viabilidade celular.
- Incube o tecido cerebral novamente a 37 ° C por 10 minutos, seguido de pipetagem para cima e para baixo 10-13 vezes usando uma ponta regular de 1.000 μl sem cortes. Não pipete para cima e para baixo mais de 15 vezes, para evitar a morte celular.
- Pare a digestão enzimática adicionando 2 ml de solução de lavagem (etapa 1.5) e centrifugue a suspensão celular a 800 x g por 5 min à temperatura ambiente (RT). Decantar cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender o sedimento na solução restante, batendo vigorosamente no tubo com um dedo e, em seguida, pipetando para cima e para baixo com uma ponta regular de 1.000 μl. Em seguida, adicione 2 ml de solução de lavagem.
- Nesta fase, verifique ao microscópio se foi obtida uma suspensão de célula única. Centrifugar novamente a suspensão celular a 800 x g durante 5 min a RT. Retirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento com 1 ml de meio fresco em condição Z (passo 1.10).
- Corar as células usando azul de tripano e contar as células vivas usando um hemocitômetro, excluindo as células mortas azuis. Prepare uma placa de 24 poços com 200 μl de suspensão celular e 300 μl de meio fresco em condição Z em cada poço. Células-semente com densidade de ~500 células/μl. Manter as células cultivadas em uma incubadora a 30 ° C em 5% de CO2, uma vez que as neuroesferas derivadas do cérebro do peixe-zebra não crescem bem a 37 ° C.
4. Geração de Neuroesferas Primárias
- Após 1 dia in vitro (DiV1), observe a suspensão de célula única obtida do cérebro inteiro adulto ao microscópio e observe se os detritos se acumularam no centro do poço. Remova cuidadosamente quaisquer detritos pipetando aproximadamente 100 μl de meio (menos se possível). Em seguida, adicione 100 μl de meio fresco de condição Z. Suspensões de células únicas devem ser observadas neste momento ( Figura 2A DiV1 ).
- Após 2 dias in vitro (DiV2), expanda as células cultivadas. Usando uma pipeta de 1.000 μl com a ponta cortada, colete e transfira 250 μl de suspensão de células de cada poço para um novo poço. Adicione 250 μl de meio fresco de condição Z em todos os poços. Antes de expandir as células cultivadas, homogeneizar a suspensão muito suavemente, pipetando para cima e para baixo em todo o poço.
- Repita as etapas 4.1 e 4.2 nos 4 dias seguintes in vitro (DiV4). Um aumento progressivo no tamanho das neuroesferas deve ser visível no centro e nas bordas do poço em DiV3 e DiV4 (Figura 2B e C).
nota: As neuroesferas primárias podem ser processadas para passagem ou diferenciação para avaliar a multipotência. Alternativamente, eles podem ser processados para nucleofecção ou lipotransfecção para caracterizar o papel de genes específicos durante o processo de diferenciação.
5. Passagem de Neuroesferas Primárias
- Remover 250 μl de cultura de tecidos de cada alvéolo e dissociar mecanicamente as neuroesferas DiV4 com uma pipeta de 1 ml. Não pipete para cima e para baixo muito rapidamente, pois a formação de bolhas de ar pode aumentar a morte celular.
- Conte as células com um hemocitômetro e distribua 800 células/μl em 250 μl de sobrenadante de cultura primária em cada poço de uma placa de 24 poços.
- Adicione 250 μl de meio de condição Z a cada poço.
- Após 2 dias in vitro (DiV2), expanda as células cultivadas conforme relatado nas etapas 4.2 e 4.3.
6. Diferenciação de Neuroesferas Primárias
- Esterilize os vidros de cobertura por imersão em etanol a 70% por 10 min e, em seguida, seque os vidros de cobertura em RT, colocando-os em cada poço de uma placa de 12 poços.
- Adicione 300 μl de solução de revestimento extracelular (etapa 1.11) no centro da lamínula de forma que ela possa se expandir amplamente e cobrir toda a lamínula. Em seguida, incubar a 37 °C durante 1 h (utilizando a incubadora de cultura de células humidificada).
- Remova a solução de revestimento extracelular após a incubação e seque a lamínula por 2 horas a 37 °C.
- Remover 250 μl de cultura de tecidos de cada alvéolo. Dissocie mecanicamente todas as neuroesferas primárias de DiV4 por poço com uma pipeta de 1 ml (com ponta mais larga) pipetando para cima e para baixo.
- Semear suspensões de células dissociadas da neuroesfera com uma densidade celular de 4 x 103 células/ml em lamínulas revestidas com matriz extracelular previamente preparadas (passo 6.1-6.3) e manter durante pelo menos 30 min, a 30 °C em 5% de CO2, até estarem ligadas ao substrato. Em seguida, remova o meio de cultura e adicione rapidamente 1 ml de meio fresco pré-aquecido para a condição de diferenciação Z (etapa 1.9) antes de cultivar as células por 24 horas a 30 ° C em 5% de CO2.
- A cada dois dias, substitua metade do meio de condição de diferenciação Z durante o tempo de diferenciação celular.
