Todos os procedimentos que envolvem a coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.
1. Geração de Organoides Cerebrais (23 dias)
- Início do neuroectoderma (5 dias)
NOTA: Os seguintes pontos devem ser considerados antes do início da diferenciação. O método de reprogramação (baseado em lentivírus, sendaivírus, episómalo ou microRNA, etc.) para obter iPSCs humanas deve ser idealmente o mesmo para todas as linhas de iPSC de pacientes e controles. Vários kits de reprogramação e instruções baseadas em protocolos publicados estão disponíveis. A qualidade das linhas iPSC humanas é a chave para realizar uma diferenciação ideal. Monitore a morfologia da colônia e da célula com um microscópio e valide a pluripotência testando a expressão de marcadores como Oct3/4, Nanog ou TRA-1-60.
- Cultura de iPSCs humanas em condições livres de alimentador em meio A em uma placa revestida com matriz Engelbreth-Holm-Swarm (EHS).
nota: Cultive iPSCs humanos sem alimentador e sem soro para manter uma condição de cultura definida e evitar uma etapa adicional para a remoção de células alimentadoras embrionárias de camundongo (MEFs) antes do início da diferenciação. O número de passagem ideal para iPSCs humanos iniciarem a diferenciação varia da passagem 15 após a reprogramação até a passagem 70 no total. Ao passar, desconecte as colônias de hiPSC à medida que as células se agregam usando uma solução apropriada de descolamento celular com baixo estresse mecânico e uma pipeta sorológica de 2 mL para transferir os agregados para um novo prato. Evite a dissociação em células únicas, pois isso pode induzir diferenciação e apoptose na maioria das linhagens de iPSC. Foi relatado que a passagem de célula única a longo prazo pode aumentar as alterações genômicas em iPSCs humanas. Evite procedimentos de descolamento celular, que requerem uma etapa de centrifugação para remover a solução de descolamento, pois isso reduz a viabilidade geral dos iPSCs. Testar regularmente todas as culturas para detecção de contaminações microbianas, em particular micoplasma, porque isso pode alterar a qualidade das iPSCs e a sua capacidade de diferenciação.
- Cubra uma placa de cultura de tecidos de 60 mm com matriz EHS de acordo com as instruções do fabricante.
- Descongele uma alíquota de 1 x 106 iPSCs humanos. Semeie as iPSCs em uma placa de cultura de tecidos de 60 mm revestida com matriz EHS e contendo 5 mL de meio A (consulte a Tabela de Materiais). Troque o meio diariamente e a passagem após 5 a 7 dias quando as células atingirem ~80% de confluência.
nota: Passe as iPSCs descongeladas a 80% de confluência usando métodos padrão, como o desprendimento de colônias sem enzimas, pelo menos uma vez antes de iniciar a diferenciação. Em resumo, remova o meio iPSC, lave as células uma vez com meio de Eagle modificado de Dulbecco a 37 ° C pré-aquecido: mistura de nutrientes F-12 (DMEM / F12) e incube os iPSCs seguindo as instruções do fabricante usando o reagente A (consulte a tabela de materiais). Não exceda o tempo de incubação recomendado para evitar a dissociação em células únicas. As iPSCs humanas devem ser destacadas e flutuar como agregados, não como células únicas. Eles podem então ser transferidos para novos pratos revestidos com matriz EHS; por exemplo, agregados iPSC de uma antena parabólica de 60 mm podem ser distribuídos para 4 novas antenas parabólicas de 60 mm.
b. Verifique se há micoplasma com um kit de detecção de micoplasma de acordo com as instruções do fabricante. Use apenas iPSCs livres de micoplasma, pois o micoplasma pode alterar a capacidade de diferenciação das iPSCs.
- Dissociar iPSCs (80% confluentes) e preparar uma suspensão unicelular usando o reagente B
- Lave os iPSCs uma vez com DMEM/F12 pré-aquecido (37 °C).
- Adicione o reagente B pré-aquecido (por exemplo, 1 mL em um prato de 60 mm) e incube as iPSCs por 5 min a 37 ° C e 5% de CO2.
- Agite 20 vezes com a ponta do dedo na lateral e no fundo do prato para soltar os iPSCs. Verifique o descolamento de células sob o microscópio.
- Pipete a suspensão celular para cima e para baixo no prato 5 vezes com uma micropipeta de 1 mL.
- Adicione 3 mL de meio A para diluir 1 mL de reagente B e colete a suspensão celular em um tubo de centrífuga de 15 mL.
- Gire suavemente os iPSCs (500 x g) por 4 min em temperatura ambiente.
- Ressuspenda o sedimento celular em 1 mL de meio B e conte o número de células com um hemocitômetro.
nota: Esteja ciente de usar apenas o meio B para ressuspensão. Evite usar o meio A, pois contém uma concentração muito alta de bFGF, o que pode inibir a diferenciação.
- Diluir a suspensão celular para 4,5 x 10,5 células por ml em meio B suplementado com 10 μM de inibidor da proteína quinase associada a rho (Y-27632).
- Adicione 100 μL por poço em uma placa não aderente, com fundo em V, de 96 poços.
nota: Certifique-se de que as células estejam igualmente distribuídas na suspensão, agitando o tubo a cada vez antes de retirar porções de 100 μL. É importante que cada alvéolo contenha um número de células equivalente para obter neuroesferas homogêneas em tamanho e forma (superfícies redondas e definidas).
- Gire suavemente a placa com as células a 500 x g e temperatura ambiente por 3 min e incube a 37 ° C e 5% de CO2.
- Troque o meio diariamente removendo 50 μL e adicionando 50 μL de meio B fresco em cada poço pelos próximos 5 dias.
2. Incorporação de Neuroesferas na Matriz EHS (4 dias)
- Prepare o meio da neuroesfera misturando o seguinte: mistura 1:1 de DMEM/F12 e meio C (v/v), suplemento 1:200 (v/v) 1, suplemento 1:100 (v/v) 2 sem (sem fio) Vitamina A, 1:100 L-glutamina, 0,05 mM de aminoácidos não essenciais (MEM), 100 U/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina, 1,6 g/L de insulina e 0,05 mM de β-mercaptoetanol.
- Colete as neuroesferas com uma micropipeta de 200 μL usando uma ponta de ~ 2 mm previamente cortada com tesoura estéril.
- Coloque as neuroesferas a aproximadamente 5 mm de distância umas das outras em filme de parafina (3 x 3 cm2) em um prato vazio de 100 mm e remova cuidadosamente o máximo possível do meio restante.
- Adicione uma gota (7 μL) de matriz EHS em cada neuroesfera.
- Incubar as gotas da matriz EHS com as neuroesferas por 15 min em uma incubadora.
- Lave cuidadosamente as neuroesferas do filme de parafina, lavando-as com meio de neuroesfera. Para lavar, use uma micropipeta de 1 mL e uma nova placa de Petri de 100 mm contendo 10 mL de meio neuroesfera.
- Incube as neuroesferas pelos próximos 4 dias e adicione 2 mL de meio neurosfera fresco no dia 2.
nota: Certifique-se de que as prateleiras da incubadora sejam planas para que as neuroesferas incorporadas à matriz EHS não se aglomerem em um lado do prato.
3. Organoides em uma cultura de suspensão rotativa (14 dias)
- Prepare o meio organoide cerebral misturando o seguinte: mistura 1:1 de DMEM/F12 e meio C (v/v), suplemento 1:200 (v/v) 1, suplemento 1:100 (v/v) 2 sem vitamina A, 1:100 L-glutamina, 0,05 mM MEM, 100 U/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina, 1,6 g/L de insulina, 0,5 μM de dorsomorfina, 5 μM SB431542, e 0,05 mM β-mercaptoetanol.
- Adicione 100 mL de meio organoide cerebral a cada frasco giratório através de seus braços laterais e coloque-os em uma incubadora para pré-aquecimento por pelo menos 20 min.
- Estabeleça um programa de agitação a 25 rpm, de acordo com as instruções do fabricante.
nota: Antes de transferir as neuroesferas incorporadas à matriz EHS para frascos giratórios, certifique-se de que estejam todas separadas. Se dois ou mais estiverem conectados através da matriz EHS, separe-os cortando a matriz de conexão com um bisturi.
- Transfira cuidadosamente as neuroesferas embebidas na matriz EHS para frascos giratórios contendo 100 mL de meio organoide usando uma pipeta sorológica de 2 mL. Use os braços laterais do frasco giratório para transferir as neuroesferas para o frasco.
- Colocar os balões giratórios numa plataforma de agitação magnética numa incubadora a 37 °C e CO2 a 5%; este é o dia 0 da cultura organoide.
- Troque o meio uma vez por semana (ou com mais frequência quando houver uma mudança de cor) removendo metade do meio e adicionando a mesma quantidade de meio fresco.
nota: Ao retirar os frascos giratórios da incubadora, espere de 3 a 5 minutos para que os organoides afundem no fundo do frasco. Remova o meio colocando a ponta da pipeta de vidro (conectada a uma bomba) na superfície do líquido; Aspirar cuidadosamente o meio através de uma abertura/braço lateral do balão. Essas manipulações devem ser feitas sob a coifa laminar.
