Diferenciação induzida por estimulação elétrica de células-tronco neurais e progenitoras

Resumo

Fonte: Chang, H. et al., Diferenciação de células precursoras neurais induzidas por campo elétrico em dispositivos microfluídicos.J. Vis. Exp. (2021)

Este vídeo demonstra o uso de um chip microfluídico revestido com matriz extracelular para diferenciar células-tronco neurais e progenitoras ou NPCs por meio de estimulação elétrica. Após a semeadura e aderência à região revestida, os NPCs crescem e a aplicação de uma corrente contínua desencadeia sua diferenciação em neurônios, astrócitos e oligodendrócitos.

Protocolo

1. Projeto e fabricação do chip eletrotático (MOE) multicanal, opticamente transparente

1. Desenhe padrões para camadas individuais de polimetilmetacrilato (PMMA) e a fita dupla face usando o software apropriado (Figura 1A, Tabela de Materiais). Corte as folhas de PMMA e a fita dupla-face com um riscador de máquina a laser CO₂ (Figura 1B).
   1. Ligue o gravador a laser CO₂ e conecte-o a um computador pessoal. Abra o arquivo de padrão projetado usando o software.
   2. Coloque as folhas de PMMA (275 mm x 400 mm) ou fita dupla face (210 mm x 297 mm) na plataforma do gravador a laser (Figura 2A). Focalize o laser na superfície das folhas de PMMA ou na fita dupla-face usando a ferramenta de foco automático.
   3. Selecione o riscador a laser como impressora e, em seguida, "imprima" o padrão usando o gravador a laser para iniciar a ablação direta na folha de PMMA ou fita dupla face e obter padrões individuais na folha ou fita de PMMA (Figura 2B).
2. Remova a película protetora das folhas de PMMA e limpe a superfície com gás nitrogênio.
   nota: O desenho do padrão de PMMA e a usinagem direta da chapa de PMMA foram realizados de acordo com um relatório prévio.
3. Para unir várias camadas de folhas de PMMA, empilhe três pedaços de folhas de PMMA de 1 mm (Camadas 1, 2 e 3) e cole-as sob uma pressão de 5 kg/^cm2 em um adesivo térmico por 30 min a 110 °C para formar o conjunto do canal de fluxo/estimulação elétrica (Figura 2C).
   nota: Diferentes lotes de folhas de PMMA obtidas comercialmente têm temperaturas de transição vítrea (Tg) ligeiramente diferentes. A temperatura ideal de ligação precisa ser testada em incrementos de 5 °C próximos à Tg.
4. Cole 12 peças de adaptadores nas aberturas individuais na Camada 1 do conjunto do chip MOE com cola de cianoacrilato de ação rápida.
   nota: Os adaptadores são feitos de PMMA por moldagem por injeção. As superfícies planas na parte inferior são para conexão ao chip MOE. Os adaptadores com roscas de parafuso fêmea 1/4W-28 são para conectar plugues brancos apertados com os dedos, conectores de fundo plano ou adaptadores Luer. Tenha cuidado ao usar cola de cianoacrilato de ação rápida. Evite espirrar nos olhos.
5. Desinfete os substratos de PMMA de 1 mm (Camadas 1-3), a fita dupla face (Camada 4) e o PMMA de grau óptico de 3 mm (Camada 5) usando irradiação ultravioleta (UV) por 30 min antes de montar o chip (Figura 1A).
6. Cole os substratos de PMMA de 1 mm (Camadas 1-3) no PMMA de grau óptico de 3 mm (Camada 5) com a fita dupla face (Camada 4) para concluir a montagem do PMMA (Camadas 1-5) (Figura 1A).
7. Prepare a lamínula limpa para a montagem no chip.
   1. Encha uma diluição de dez vezes do detergente em um frasco de coloração (consulte a Tabela de Materiais) e limpe a lamínula com um limpador ultrassônico por 15 min.
   2. Enxágue bem o frasco de coloração em água corrente da torneira para remover todos os vestígios do detergente.
   3. Continue enxaguando com água destilada para remover todos os vestígios de água da torneira e repita a etapa 1.7.2 duas vezes.
   4. Seque a lamínula limpa soprando-a com gás nitrogênio.
8. Desinfete o conjunto de PMMA (Camadas 1-5), a fita dupla-face (Camada 6) e a lamínula (Camada 7) usando irradiação UV dentro de um gabinete de biossegurança por 30 min antes de montar o chip (Figura 1A).
9. Cole a lamínula limpa (Camada 7) ao conjunto de PMMA (Camadas 1-5) com a fita dupla-face (Camada 6) (Figura 1A).
10. Incube o chip MOE em uma câmara de vácuo durante a noite; use o conjunto do chip MOE para procedimentos subsequentes (Figura 3).

2. Revestimento de poli-L-lisina (PLL) no substrato nas regiões de cultura de células

1. Prepare o tubo de politetrafluoretileno, o conector de fundo plano, o conector cônico, o adaptador cônico-Luer, o plugue branco estanque aos dedos (também chamado de rolha), o adaptador Luer, a seringa Luer lock e o tampão de borracha preta (Figura 4A, Tabela de Materiais). Esterilize todos os componentes acima em uma autoclave a 121 ° C por 30 min.
2. Sele as aberturas dos adaptadores da ponte de ágar (Figura 1A) com os bujões brancos de aperto manual. Conecte o conector de fundo plano ao conjunto do chip MOE por meio dos adaptadores de entrada e saída médios (Figura 4B). Conecte o adaptador cone-Luer às torneiras de 3 vias.
3. Adicione 2 mL de solução PLL a 0,01% usando uma seringa de 3 mL que se conecta à torneira de 3 vias da entrada do meio (Figura 4B-).
4. Conecte uma seringa vazia de 3 mL à torneira de 3 vias da saída do meio (Figura 4B-).
5. Encha as regiões de cultura de células com a solução PLL. Bombeie manualmente a solução de revestimento para frente e para trás lentamente. Feche as duas torneiras de 3 vias para selar a solução dentro das regiões de cultura.
6. Incubar o chip MOE a 37 °C durante a noite em uma incubadora cheia de 5% de atmosfera de CO₂.

3. Preparação da rede de pontes salinas

1. Seguindo a etapa 2.6, abra as duas torneiras de 3 vias e lave as bolhas nos canais bombeando manualmente a solução de revestimento para frente e para trás no canal usando as duas seringas.
2. Desenhe 3 mL de meio completo (meio de manutenção de células-tronco consistindo de meio de Eagle modificado de Dulbecco/mistura de nutrientes de Ham F-12 (DMEM/F12), suplemento de 2% de B-27, 20 ng/mL EGF e 20 ng/mL de bFGF) em uma seringa de 3 mL que se conecta à torneira de 3 vias da entrada do meio (Figura 4B- e Figura 4B- ).
3. Adicione 3 mL de meio completo para substituir a solução de revestimento nas regiões de cultura de células. Conecte uma seringa vazia de 5 mL à torneira de 3 vias da saída do meio (Figura 4B-).
4. Prepare a rede da ponte salina (Figura 5).
   1. Corte o tampão de borracha preta para produzir uma lacuna e insira os eletrodos de prata (Ag)/cloreto de prata (AgCl) através do tampão de borracha preta e na seringa Luer lock (Figura 4A).
   2. Substitua o plugue branco à prova de dedos pelo adaptador Luer e injete agarose quente a 3% para encher o adaptador Luer.
      nota: Para a preparação da agarose quente, dissolva 3 g de pó de agarose em 100 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) e esterilize em autoclave a 121 °C por 30 min.
   3. Conecte a seringa Luer lock ao adaptador Luer. Injete agarose quente a 3% através do tampão de borracha preta para encher a seringa Luer lock usando a seringa com agulha. Aguarde de 10 a 20 minutos para que a agarose esfrie e solidifique.
      nota: Para aumentar a capacidade de volume da agarose, a seringa Luer lock é montada no adaptador Luer (Figura 4 e Figura 5). Em seguida, os eletrodos grandes são inseridos na seringa Luer lock. O eletrodo é capaz de fornecer uma estimulação elétrica estável para o experimento de longo prazo.

4. Preparação de mNPCs

1. Cultivar os mNPCs no meio completo em um frasco de cultura de células 25T a 37 ° C em uma incubadora cheia de atmosfera de CO_{5% 2}. Subcultive as células a cada 3-4 dias e realize todos os experimentos com células que passaram por 3-8 passagens da fonte original.
2. Transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mL e gire as neuroesferas a 100 × g por 5 min. Aspire o sobrenadante e lave as neuroesferas com 1x PBS de Dulbecco (DPBS). Gire as neuroesferas a 100 × g por 5 min.
3. Aspire o 1x DPBS e, em seguida, ressuspenda as neuroesferas no meio completo. Misture bem e delicadamente.
4. Adicione 1 mL da suspensão da neuroesfera usando uma seringa de 1 mL que se conecta à torneira de 3 vias da saída (Figura 4B-).

5. Configuração do sistema microfluídico para estimulação de pulso DC (Figura 6)

1. Instale o chip MOE semeado por célula no aquecedor transparente de óxido de índio-estanho (ITO) que é fixado em um estágio motorizado XYZ programável.
   nota: A temperatura da superfície ITO é controlada por um controlador proporcional-integral-derivativo e mantida a 37 °C. Um termopar tipo K é preso entre o chip e o aquecedor ITO para monitorar a temperatura das regiões de cultura de células dentro do chip. O chip MOE é instalado em um estágio motorizado XYZ programável e é adequado para aquisição automática de imagem com lapso de tempo em seções de canal individuais. A fabricação do aquecedor ITO e a configuração do sistema de aquecimento de cultura de células foram descritas anteriormente.
2. Infundir os mNPCs por bombeamento manual no chip MOE através da saída média. Incubar o chip MOE semeado por célula no aquecedor ITO de 37 °C por 4 h.
3. Após 4 h, bombeie o meio completo através do chip MOE através da entrada do meio a uma taxa de fluxo de 20 μL/h usando uma bomba de seringa.
   nota: Os mNPCs são cultivados e mantidos no chip por mais 24 horas antes da estimulação dos campos elétricos (EF) para permitir a fixação e o crescimento celular. O líquido residual é coletado em uma seringa vazia de 5 mL conectada à torneira de 3 vias da saída, mostrada como "resíduo" na Figura 6A. A configuração do sistema microfluídico MOE é mostrada na Figura 6. Este sistema microfluídico fornece um suprimento contínuo de nutrição para as células. O meio fresco completo é continuamente bombeado para o chip MOE para manter um valor de pH constante. Portanto, as células podem ser cultivadas fora de uma incubadora de CO₂.
4. Use fios elétricos para conectar um multiplexador EF ao chip MOE por meio dos eletrodos Ag/AgCl no chip. Conecte um multiplexador EF e um gerador de função a um amplificador para emitir pulsos CC de onda quadrada com uma magnitude de 300 mV/mm a uma frequência de 100 Hz a 50% dos ciclos de trabalho (50% de tempo ligado e 50% de tempo desligado) (Figura 6B).
   1. Conecte os fios elétricos ao multiplexador EF. Conecte os fios elétricos ao chip MOE através dos eletrodos Ag/AgCl.
   2. Conecte o multiplexador EF ao amplifier usando fios elétricos. Conecte o gerador de funções ao amplificador e ao osciloscópio digital.
      nota: O multiplexador EF é um circuito que inclui a impedância da câmara de cultura no circuito e conecta todas as câmaras individuais em uma rede eletrônica paralela. Cada uma das três câmaras de cultura é conectada eletricamente em série a um resistor variável (Vr) e um amperímetro (mostrado como μA na Figura 6A) no multiplexador. A corrente elétrica através de cada câmara de cultura é variada controlando o Vr, e a corrente é mostrada no amperímetro correspondente. A intensidade do campo elétrico em cada região de cultura de células foi calculada pela Lei de Ohm, I = σEA, onde I é a corrente elétrica, σ (definido como 1,38 S·^m-1 para DMEM / F12) é a condutividade elétrica do meio de cultura, E é o campo elétrico e A é a área da seção transversal da câmara eletrotática. Para a dimensão da região de cultura de células mostrada na Figura 1, a corrente elétrica é de ~87 mA e ~44 mA para pulso DC e DC no ciclo de trabalho de 50%, respectivamente.
5. Sujeite os mNPCs a pulsos CC quadrados com magnitude de 300 mV/mm na frequência de 100 Hz por 48h. Bombeie continuamente o meio completo a uma taxa de 10 μL/h para fornecer nutrição adequada às células e manter um valor de pH constante no meio.

Resultados

Figura 1: A configuração detalhada do chip eletrotático opticamente transparente multicanal.(A) Vista explodida do conjunto do chip MOE. O chip MOE consiste em folhas de PMMA (50 mm x 25 mm x 1 mm), fita dupla face (50 mm x 25 mm x 0,07 mm), adaptadores (10 mm x 10 mm x 6 mm), folha de PMMA de grau óptico (50 mm x 75 mm x 3 mm), fita dupla face (24 mm x 60 mm x 0,07 mm), e uma lamín...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Substratos de PMMA de 1 mm (Camadas 1-3)	Bht	K2R20	Polimetilmetacrilato (PMMA), http://www.bothharvest.com/zh-tw/product-421076/Optical-PMMA-Non-Coated-BHT-K2Rxx-xx=-thickness-choices.html
Tubo plástico de 15 mL	Empresa Co. da tecnologia de Protech, Ltd	CT-15-PL-TW	Tubo de fundo cônico com tampa, montado, pré-esterilizado
Seringa de 3 ml	TERUMO	DVR-3413	Seringas orais de 3 mL, sem agulha
PMMA de grau óptico de 3 mm (Camada 5)	Corporação CHI MEI	Folha ACRYPOLY PMMA	PMMA de grau óptico
Torneira de 3 vias	NIPRO	NCN-3L	Torneira descartável estéril de 3 vias
Seringa de 5 mL	TERUMO	DVR-3410	Seringas orais de 5 mL, sem agulha
adaptador	Fornecedor verificado - Dong Zhong Co., Ltd.	Personalizado	Adaptador PMMA
agarose	Sigma-Aldrich	A9414	Agarose, baixa temperatura de gelificação
amplificador	A.A. Sistemas de Laboratório Ltda	A-304	Amplificador de alta tensão
Software AutoCAD	Autodesk	Versão Educacional	Elaboração
Suplemento B-27	Gibco	Rolamento 12587-010	Suplemento B-27 (50x), menos vitamina A
Fator básico de crescimento de fibroblastos (bFGF)	Peprotech	AF-100-18B	Também chamado de FGF-básico humano recombinante
Tampão de borracha preta	TERUMO	DVR-3413	A partir de seringas orais de 3 mL, sem agulha
Albumina de soro bovino (BSA)	Sigma-Aldrich	B4287	Reagente de bloqueio
centrifuga	HSIANGTAI	CV2060	centrifuga
Scriber a laser de CO2	Ferramentas e técnicas a laser Corp.	ILS-II	Comprado de http://www.lttcorp.com/index.htm
Conector de cone	IDEX Saúde e Ciência	F-120X	Cone de uma peça com os dedos 10-32, para 1/16" OD natural
Adaptador Cone-Luer	IDEX Saúde e Ciência	Pág. 659	Adaptador Luer 10-32 Fêmea para Fêmea Luer, PEEK
Microscópio de fluorescência confocal	Leica Microsystems	TCS SP5	Manual do usuário do Leica TCS SP5, http://www3.unifr.ch/bioimage/wp-content/uploads/2013/10/User-Manual_TCS_SP5_V02_EN.pdf
Câmera digital	Olimpo	E-330	Aquisição automática de imagens com lapso de tempo
Osciloscópio digital	Tektronix	TDS2024	Meça sinais de tensão ou corrente ao longo do tempo em um circuito ou componente eletrônico para exibir amplitude e frequência.
Fita dupla face	3m	ANIMAL DE ESTIMAÇÃO 8018	Comprado de http://en.thd.com.tw/
Meio de Eagle modificado de Dulbecco/mistura de nutrientes de Ham F-12 (DMEM/F12)	Gibco	12400024	DMEM/F-12, pó, HEPES
Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS)	Gibco	21600010	DPBS, pó, sem cálcio, sem magnésio
Multiplexador EF	Fornecedor verificado - Asiatic Sky Co., Ltd.	Personalizado	Monitore e controle a corrente elétrica em canais individuais
Fator de crescimento epidérmico (EGF)	Peprotech	AF-100-15	Também chamado de EGF humano recombinante
Cola de cianoacrilato de ação rápida	3m	7004T	Adesivo instantâneo de força (líquido)
Conector de fundo plano	IDEX Saúde e Ciência	Pág. 206	Porca macho sem flange Delrin, 1/4-28 fundo plano, para 1/16" OD azul
Gerador de funções	Tecnologias Agilent	33120A	Gerador de função sintetizada de 15 MHz de alto desempenho com capacidade de forma de onda arbitrária integrada
Vidro de óxido de índio-estanho (ITO)	Merck	300739	Para aquecedor ITO
Termopar tipo K	Tecpel	TPK-02A	Termopares de temperatura
Adaptador Luer	IDEX Saúde e Ciência	Pág. 618-01	Adaptador Luer fêmea Luer para polipropileno macho 1/4-28
Seringa Luer lock	TERUMO	DVR-3413	Para pontes de sal de ágar
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)	Vida básica	BL2651	Solução de lavagem
Poli-L-lisina (PLL)	sigma	Pág. 4707	Solução de revestimento
Espessura de vidro de cobertura de precisão nº 1,5H	MARIENFELD	107242	https://www.marienfeld-superior.com/precision-cover-glasses-thickness-no-1-5h-tol-5-m.html
Estágio motorizado X-Y-Z programável	Tanlian Inc	Personalizado	Comprado de http://www.tanlian.tw/ndex.files/motort.htm
Controlador proporcional-integral-derivativo (PID)	Toho Eletrônica	TTM-J4-R-AB	Controlador de temperatura
Tubo de PTFE	Plásticos Profissionais Inc. Filial de Taiwan	Diâmetro externo 1/16 polegadas	Tubulação translúcida branca de PTFE
Bomba de seringa	Sistemas Nova Era Inc	NE-1000	Bomba de seringa única programável NE-1000
Detergente TFD4	FRANKLAB	TFD4	Limpador de vidro de cobertura
Ligação térmica	Fornecedor:Kuan-MIN Tech Co.	Personalizado	Comprado de http://kmtco.com.tw/
Limpador ultrassônico	Leão	LEO-300S	Limpador de esterilização ultrassônico
Câmara de vácuo	DENG YNG INSTRUMENTS CO., Ltd.	DOV-30	Forno de secagem a vácuo
Plugue branco à prova d'água	IDEX Saúde e Ciência	Pág. 316	1/4-28 Fundo Plano, https://www.idex-hs.com/store/fluidics/fluidic-connections/plug-teflonr-pfa-1-4-28-flat-bottom.html