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Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.
A Figura 1 ilustra uma visão geral esquemática do fluxo de trabalho desse protocolo.
1. Reprogramação e manutenção do iPSC
- Colete 8 mL do sangue do sujeito (idoso ou doente; com 65 anos ou mais) em tubos de preparação celular (CPT) com citrato de sódio ou em ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) ou tubos heparinizados.
- Centrifugue a 1.800 x g por 30 min em temperatura ambiente (RT) para coletar pellets contendo apenas sangue periférico e sem soro.
- Use vetores de reprogramação especializados de acordo com o protocolo do fabricante (consulte a Tabela de Materiais) para obter iPSCs.
- Cultura de iPSCs em placas de cultura de 6 poços revestidas com matriz de membrana basal sem alimentador e sem lactose desidrogenase (LDEV) com fator de crescimento reduzido em meio Essential 8 (E8) (ver Tabela de Materiais) a 37 ° C em uma atmosfera umidificada com 5% de CO2.
- Mantenha iPSCs em meios E8 por 3-4 dias para evitar superlotação ou diferenciação espontânea.
- Validar a pluripotência das linhas iPSC usando marcadores imunofluorescentes (etapa 2) e testar micoplasma (etapa 3).
2. Coloração de pluripotência
- Para conservar soluções e anticorpos, semeie as células em placas de cultura de 24 poços revestidas (etapa 1.4) 3-4 dias antes da análise. Aspire o meio com uma pipeta e fixe as células com formaldeído a 4% em solução salina tamponada com fosfato (1x PBS) por 15-20 minutos em RT.
- Lave as células 3x com 1x PBS e permeabilize com 0,1% de Triton-X 100 em albumina de soro bovino (BSA) a 1% em PBS por pelo menos 15 min, mas não mais do que 1 h em RT.
- Lave 3x com 1x PBS e bloqueie com 5% BSA em PBS por 30 min em RT.
- Lave novamente 3x com 1x PBS e adicione os anticorpos Sox2 e Oct3/4 (diluição 1:100; ver Tabela de Materiais) e a coloração nucleica DAPI em 1% BSA (diluição 1:4.000) durante a noite a 4 ° C. Embrulhe em papel alumínio para proteger da luz.
- Lave 3x com 1x PBS e deixe as células em PBS. Imagem com um microscópio de fluorescência com uma ampliação de 10-20x. Certifique-se de que os marcadores de pluripotência região determinante do sexo Y-box 2 (Sox2) e fator de transcrição de ligação ao octâmero 3/4 (Oct3/4) estejam localizados nos núcleos das células.
3. Teste de micoplasma
NOTA: Consulte o protocolo do kit de detecção (consulte a Tabela de Materiais) para obter etapas detalhadas de execução e análise do ensaio. O kit de detecção fornece o reagente, o substrato e o tampão de ensaio para testes de micoplasma.
- Antes de passar células ou meio refrescante, colete 2-3 mL de meio de cultura celular em um tubo de centrífuga e pulverize quaisquer células ou detritos a 200 x g por 5 min em RT. Armazene o sobrenadante a 4 ° C por ≤5 dias. Incubar as células com o meio durante, pelo menos, 24 h para garantir um sinal detectável.
- Adicione 100 μL de sobrenadante celular a um tubo novo ou poço de uma placa de 96 poços de parede branca (recomenda-se fundo opaco, consulte a Tabela de Materiais). Reconstituir o reagente e o substrato no tampão de ensaio e equilibrar durante 15 min em RT.
- Adicionar 100 μL do reagente à amostra e incubar durante 5 min a RT. Medir a luminescência com um luminómetro (medição #1).
- Adicionar 100 μL do substrato à amostra e incubar durante 10 min a RT. Medir a luminescência (medição #2).
- Determine a contaminação por micoplasma pela proporção da medição # 2 para # 1. Consulte o manual do kit para interpretação dos resultados.
4. Preparação de microfilamentos
- Comece a preparação dos microfilamentos de poli (ácido lático-co-glicólico) (PLGA, consulte a Tabela de Materiais) desfiando o fio de sutura com a ponta romba de um bisturi. Castre a fibra desgastada levemente com etanol 70%.
- Sob o microscópio e usando uma régua, comece a cortar a fibra de PLGA em fragmentos de fios de 500 μm a 1 mm de comprimento. Corte cerca de 25 mm da fibra no total. Mantenha os filamentos em um tubo de 15 mL com uma solução antibiótico-antimicótica de 1 mL.
- Na coifa, diluir a solução fibrosa com 10 mL de DMEM/F-12 (Tabela 1). Vortex bem para misturar a solução.
nota: Trabalhe em uma capela de fluxo de cultura de células em um ambiente estéril.
- Adicione 20 μL da solução de fibra a três poços formadores de corpo embrióide (EB) de uma placa de 96 poços. Sob microscopia de campo claro, conte e calcule a média das fibras por poço. Dilua ou concentre em uma média de 5 a 10 microfilamentos de PLGA por poço. Prepare cada poço dessa maneira.
- Os poços agora estão prontos para serem semeados com células. Conservar a placa à temperatura ambiente até ser necessário ou a 4 °C no dia seguinte.
5. Formação do corpo embrióide (EB)
NOTA: Todas as mídias e soluções devem ser aquecidas para RT.
- Uma vez que as iPSCs tenham atingido 70%-80% de confluência (Figura 2A), elas estão prontas para serem passadas e usadas para a formação de EB. Verifique as células com um microscópio com ampliação de 10x-20x. Certifique-se de que as colônias exibam áreas mínimas (<10%) de diferenciação espontânea.
- Aspire o meio com uma pipeta e lave as células uma vez com solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS). Dissocie as colônias adicionando 500 μL de solução de descolamento celular (ver Tabela de Materiais) ou 0,5 mM de EDTA e incube por 3-5 min a 37 ° C.
nota: Trabalhe em uma capela de fluxo de cultura de células em um ambiente estéril.
- Colete as células liberadas adicionando 1 mL de meio E8 fresco a cada poço e pipete suavemente até que todas as células estejam separadas.
- Transfira 1,5 mL de suspensão celular para um tubo de 15 mL e adicione mais 1 mL de meio E8 fresco para atingir um volume total de 2,5 mL.
- Centrifugue a 290 x g durante 3 min a RT.
- Aspire o sobrenadante com uma pipeta, ressuspenda o pellet celular em 1 mL de meio Essential 6 (E6, consulte a Tabela de Materiais) suplementado com 50 μM de inibidor da proteína quinase associada a Rho (ROCK) e conte as células usando um hemocitômetro.
- Prepare uma suspensão celular de 60.000-90.000 células/mL, dependendo da densidade de semeadura desejada, em meio E6 suplementado com 50 μM de inibidor de ROCK (ver Tabela de Materiais).
- Adicione 150 μL da suspensão celular em cada poço de uma placa de fixação ultrabaixa (ULA) de 96 poços (ou uma placa côncava preparada). Semeie 9.000-11.000 células por poço.
- Centrifugue a placa para agregar as células à força a 290 x g por 1 min em RT. Coloque a placa na incubadora a 37 ° C em uma atmosfera umidificada com 5% de CO2.
6. Indução neuroepitelial
- Após 24 h, aspire cuidadosamente 120 μL do meio com uma pipeta. Certifique-se de não aspirar o EB abaixando a ponta da pipeta muito para dentro do poço.
- Adicione 150 μL de meio E6 (em RT) suplementado com 2 μM de XAV939 e o Supressor de Mães contra Inibidores Decapentaplégicos (SMAD): 10 μM de SB431542 e 500 nM de LDN 193189 por poço (ver Tabela de Materiais).
- Troque o meio diariamente com meio E6 recém-preparado suplementado com 2 μM de XAV939, 10 μM de SB431542 e 500 nM de LDN 193189.
nota: No dia 6 (DIV6), os EBs devem ter um diâmetro de 550-600 μm e estar prontos para maior diferenciação.
7. Diferenciação e maturação de organoides
NOTA: Todas as mídias precisam ser aquecidas para RT.
- Em aproximadamente DIV7, verificar se todos os EBs atingiram um diâmetro de 550-600 μm e exibem uma borda lisa e clara (Figura 2B); nesta fase, eles estão prontos para serem incorporados em uma matriz extracelular (MEC).
nota: Trabalhe em um ambiente estéril.
- Prepare as folhas de incorporação onduladas do filme de vedação termoplástico (consulte a Tabela de Materiais) colocando uma folha de filme (cerca de 4 polegadas de comprimento) em uma caixa P200 vazia. Usando um tubo cônico de 15 mL ou um tubo de microcentrífuga de 500 μL, pressione suavemente a folha de filme nos orifícios para fazer 12 covinhas. Pulverize a folha de filme com etanol 70% e deixe secar dentro da capela de fluxo com a luz UV acesa por pelo menos 30 min.
- Descongele uma quantidade suficiente de matriz de membrana basal (Matrigel, consulte Tabela de Materiais) no gelo e coloque-a dentro da coifa de fluxo.
nota: Por EB, são necessários aproximadamente 30 μL de matriz de membrana não diluída. Mantenha sempre a matriz da membrana abaixo de 4 °C para evitar que gelifique. As ponteiras de pipeta pré-resfriadas também são recomendadas, pois desaceleram a matriz da polimerização na ponteira durante a pipetagem, reduzindo assim a perda de material.
- Usando uma ponta P200 de diâmetro largo, transfira um EB para cada covinha e remova o máximo de mídia possível com uma ponta de pipeta normal. Esteja atento para não deixar os EBs secarem. Usando uma ponta P200 regular, adicione ~ 30 μL de matriz de membrana não diluída a cada organoide, garantindo que o EB esteja no centro da gota.
- Uma vez que todos os EBs estejam embutidos na matriz, coloque a folha de filme contendo os EBs em uma placa de Petri estéril.
nota: Opcionalmente, uma pequena placa de Petri cheia de água estéril pode ser colocada na placa de Petri maior ao lado da folha de filme para evitar a evaporação.
- Transfira o prato para uma incubadora e incube a 37 ° C em uma atmosfera umidificada com 5% de CO2 por aproximadamente 10 min para permitir que a matriz da membrana solidifique.
- Para cada conjunto de 12 organoides incorporados, prepare 5 mL de meio de diferenciação com B27 sem vitamina A (Tabela 1) em um poço de uma placa ULA de 6 poços. Pré-aqueça a placa a 37 °C em uma incubadora.
- Quando o tempo de incubação terminar, transfira os EBs embutidos para a placa de 6 poços ULA pegando a folha de filme e empurrando as covinhas da parte de trás da folha. Se necessário, retire 1 mL do poço e pipete-o sobre a folha para ajudar as gotículas a se soltarem do filme.
nota: Alterações morfológicas importantes podem ser observadas 1 dia após a incorporação; Os EBs passam de bordas lisas a saliências salientes formando botões (Figura 2C).
- Após 2 dias (DIV9), execute uma troca de meia mídia. Tenha cuidado para não aspirar ou danificar as gotículas da matriz da membrana no processo.
- Após mais 2 dias (DIV11), execute uma troca completa de meio, complementando o meio com 3 μM de CHIR99021 (consulte a Tabela de Materiais).
- No DIV14, troque o meio para meio de diferenciação com B27 com vitamina A (Tabela 1) para um aumento gradual no tamanho do organoide.
- No DIV16, coloque a placa do poço em um agitador orbital a 90 rpm dentro de uma incubadora. Mude a mídia a cada 2 dias.
- A cada 40 DIV, diluir 500 μL da matriz de membrana para cada 50 mL de meio para obter nutrientes adicionais no meio.
Tabela 1: Composição dos meios de diferenciação utilizados no presente estudo.
| Reagente | Concentração Final | Volume (50 mL total) |
| DMEM-F12 | 50% de sucesso | 25 mL |
| Meio Neurobasal | 50% de sucesso | 25 mL |
| Suplemento N2 (100x) | 1x | 0,25 mL |
| Suplemento B27 -/+ Vitamina A (50x) | 0,5x | 0,5 mL |
| insulina | 0,25% | 12,5 μL |
| GlutaMAX (100x) | 1x | 0,5 mL |
| MEM-NEAA (100x) | 0,5x | 0,25 mL |
| HEPES (1 M) | 10 mM | 0,5 mL |
| Antibiótico/Antimicótico (100x) | 1x | 0,5 mL |
| 2-β-mercaptoetanol | 50 μM | 17,5 μL |
| NOTA: alguns DMEM-F12 já contêm GlutaMAX, não há necessidade de adicionar adicionais. |
