Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.
1. Dissecção de Embriões e Dissociação de Tecidos
- Abrigar ratos fêmeas adultos (200-250 g) a uma temperatura constante (22 ± 1 °C) e umidade relativa (50%) sob um horário regular de luz-escuridão (claro das 7h às 19h) no biotério. Certifique-se de que comida e água estejam disponíveis gratuitamente.
- Anestesiar uma rata grávida após 18 dias de desenvolvimento (E18) usando isoflurano a 3%. Em seguida, sacrifique o animal por luxação cervical.
- Remova o hipocampo de cada embrião de rato e coloque-os na solução salina balanceada de Hank gelada sem Ca2+ e Mg2+. No dia 18 de desenvolvimento, os tecidos do hipocampo e do córtex são muito macios e não precisam ser cortados em pequenos pedaços. Mais detalhes podem ser encontrados.
- Dissocie o tecido em 0,125% de solução de tripsina / Hank contendo 0,05% de DNAse por 18-20 min a 37 ° C.
- Remova a solução sobrenadante com uma pipeta Pasteur e interrompa a digestão enzimática adicionando meio com 10% de soro fetal bovino (FBS) por 5 min.
- Remova o meio com FBS e lave uma vez com o meio com seu suplemento, L-glutamina a 1%, gentamicina 10 μg / ml. Remova novamente o meio com uma pipeta Pasteur e reabasteça-o novamente com uma pequena quantidade (500 μl) de meio de crescimento com seu suplemento, L-glutamina a 1%, gentamicina 10 μg / ml.
- Dissocie o sedimento de tecido mecanicamente com uma pipeta de Pasteur estreita até que uma suspensão leitosa de células seja aparente. Não é necessário centrifugar a suspensão celular.
- Diluir o pequeno volume de suspensão celular com o meio de crescimento até obter um volume final de 2,0 ml. Contar a concentração celular obtida com uma câmara de hemocitômetro. Diluir esta concentração a 1:5 para obter a concentração celular desejada de 600-700 células/μl.
2. Revestimento celular
- Células de placa com uma densidade de cerca de 2.000 células/mm2 na área ativa do MEA, definida pela restrição PDMS para criar uma rede neuronal 2D.
nota: Cada hipocampo contém cerca de 5 x 105 células (1 x 106 para um único embrião). Dissecar 6 embriões para obter uma quantidade total de 6 x 106 células em 2 ml e uma concentração estimada de 3.000 células/μl. Dilua esta concentração a 1:5 para obter a concentração celular desejada e coloque cerca de 600-700 células/μl. Se a área MEA delimitada pela restrição PDMS for de cerca de 7,065 mm2, e o número total de células plaqueadas 600 células/μl x 24 μl = 14.400 células, a densidade final de 2.038 células/mm2.
- Coloque os dispositivos MEA na incubadora com atmosfera umidificada de CO2 (5%) a 37 °C.
- Distribua 160 μl da suspensão com uma concentração celular de 600-700 células/μl (cerca de 100.000 células) na superfície da monocamada de microesferas posicionada dentro das placas multipoços para completar a etapa preliminar para a construção da cultura tridimensional. Coloque as placas multipoços na incubadora com atmosfera umidificada de CO2 (5%) a 37 °C.
3. 3D Construção de Redes Neuronais
- 6-8 horas após o plaqueamento, transferir a suspensão (microesferas com neurónios) das placas multipoços com muito cuidado para dentro da área delimitada pela restrição PDMS, utilizando uma pipeta ajustada para um volume de cerca de 30-40 μl. Após cada transferência, aguarde cerca de meio minuto, para permitir que as microesferas se auto-montem em uma estrutura compacta hexagonal.
- Uma vez que todas as camadas são depositadas e montadas espontaneamente, reabasteça com uma grande gota de cerca de 300 μl de meio o topo da área delimitada pela restrição PDMS.
- Coloque a estrutura 3D acoplada ao MEA na incubadora (T = 37,0 °C, CO2 = 5%) por 48 horas antes de adicionar um volume final (cerca de 1 ml) de cultura de meio de crescimento com seu suplemento.
nota: Considere o número total de grânulos nas placas multipoços com inserção de membrana (30.000) e o número de grânulos em uma única camada no dispositivo MEA (6.000). A estrutura 3D resultante é composta por 5 camadas de microesferas e células. Considerando que a rede neuronal 3D não é geometricamente perfeita, a estrutura 3D resultante pode compreender de 5 a 8 camadas.
- No dia seguinte ao revestimento, adicione cuidadosamente o volume final do meio (cerca de 900 μl) dentro do anel MEA. Manter as culturas 3D numa atmosfera humidificada de CO2 (5%) a 37 °C durante 4-5 semanas. Substitua metade do meio uma vez por semana.
