Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Preparação e cultivo de astrócitos corticais
NOTA: Conclua essas etapas do protocolo pelo menos 7 dias antes de prosseguir para as próximas etapas, pois as culturas de astrócitos devem se desenvolver em monocamadas confluentes antes que os neurônios sejam preparados. Os astrócitos primários são derivados de culturas gliais mistas obtidas de filhotes de camundongos por volta do dia pós-natal (P) 0-3. Devem ser utilizados três cérebros (6 córtices) por balão T75.
- Prepare o meio astrócitos suplementando o Meio de Águia Modificado (DMEM) de Dulbecco com 10% v / v de soro de cavalo e 0,1% v / v de gentamicina em condições estéreis. Conservar o meio a 4 °C durante um período máximo de 2 semanas.
- Cubra 3 frascos T75 com 10 μg/ml de poli-D-lisina (PDL; em água para cultura de células) durante, pelo menos, 1 h a 37 °C na presença de 6% v/v CO2. Após o revestimento, lave os frascos duas vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS) para remover cátions não ligados e adicione 9 mL de meio de astrócitos.
- Para a preparação dos cérebros, adicione 10 mL de Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) a 1 placa de Petri de 10 cm e 1 mL de HBSS a 1 tubo de 15 mL (independentemente do número de cérebros que serão usados). Mantenha uma tesoura cirúrgica, 2 pinças finas e um binóculo ao alcance para o procedimento.
- Decapite 3 filhotes rapidamente com a tesoura cirúrgica e colete as cabeças em um prato vazio de 10 cm.
- Realize a preparação dos córtices sob os binóculos. Usando duas pinças finas, remova a pele dorsal do crânio na linha média, começando do pescoço até o nível dos olhos. Depois disso, o cérebro com seus vasos sanguíneos é visível sob o crânio.
- Fixe a cabeça na extremidade rostral com um par de pinças e faça uma incisão na linha média do crânio, começando na extremidade posterior. Posteriormente, corte as metades direita e esquerda do crânio para expor o cérebro.
- Feche a ponta da pinça e posicione-a ventralmente sob o cérebro. Levante o cérebro para fora do crânio e transfira-o para a placa de Petri de 10 cm cheia de HBSS. Proceda da mesma maneira com o espécime restante até que todos os cérebros sejam coletados no prato.
- Depois de coletar os cérebros, comece com a separação dos córtices beliscando o rombencéfalo usando uma pinça como uma tesoura. Faça uma incisão na linha média entre os dois hemisférios com um par de pinças. Fixe cuidadosamente o cérebro com uma pinça e corte o mesencéfalo e os bulbos olfatórios usando uma segunda pinça para acabar com as metades corticais.
- Fixe uma metade cortical com um par de pinças e retire as meninges dos hemisférios, destacando-as da borda lateral e, posteriormente, puxando-as da superfície cortical usando uma segunda pinça.
- Vire a metade cortical com sua superfície voltada para baixo em direção ao prato; disseque cuidadosamente e remova o hipocampo em forma de meia-lua usando um par de pinças. Transfira os córtices simples para o tubo cônico de 15 mL usando uma pinça fechada para transportar um córtex individual.
- Depois de coletar todos os córtices, transitar para a capela de fluxo laminar estéril e começar com os preparativos para a dissociação do tecido cortical.
- Adicione 1 mL de DMEM a um tubo de reação de 2 mL e adicione 0,1% p / v de papaína (30 unidades). Incubar a suspensão em banho-maria a 37 °C até se desenvolver uma solução clarificada (cerca de 3 min). Adicione 0,24 mg/mL de L-cisteína e 20 μg/mL de DNAse e agite suavemente.
NOTA: Para a digestão, é necessário aproximadamente 1 mL de solução enzimática.
- Filtre (tamanho de poro de 0,22 μm) para obter 1 mL de solução estéril antes de adicioná-la ao tecido cortical. Incubar os tubos durante 30 min - 1 h a 37 °C (ou seja, em banho-maria).
NOTA: As etapas 1.11 a 1.14 são críticas e devem ser concluídas em 15 minutos.
- Para interromper a reação de digestão, adicione 1 mL de meio de astrócitos e triture cuidadosamente o tecido digerido usando uma pipeta de 1 mL. Para trituração, mova suavemente o êmbolo da pipeta, aspirando e expulsando a suspensão do tecido cortical.
- Uma vez que o tecido tenha sido dissociado em uma suspensão unicelular, adicione 5 mL de meio de astrócitos e centrifugue por 5 min a 216 x g.
- Aspirar cuidadosamente o sobrenadante do sedimento resultante e ressuspender as células em 1 ml de meio astrócito.
- Adicionar as suspensões celulares a frascos T75 reabastecidos com 9 ml de meio de astrócitos (ver ponto 1.2).
- Incubar as células a 37 °C na incubadora na presença de 6% v/v CO2. Após 4 d, realizar a primeira troca completa do meio (10 mL). Depois disso, troque o meio de cultura a cada 2 a 3 dias.
- Após 7 dias, verifique se as células formaram uma monocamada confluente. Caso contrário, aguarde mais 2 a 3 dias até que a confluência completa da cultura seja alcançada.
NOTA: Os astrócitos exibem corpos celulares grandes e achatados, localizam-se no fundo do frasco e não desenvolvem processos celulares notáveis. Eles diferem das células progenitoras brilhantes de contraste de fase pequeno e da micróglia que residem no topo da monocamada.
- Para se livrar das células progenitoras e obter uma cultura de astrócitos puros, colocar os frascos T75 num agitador orbital e agitar as culturas O/N a 250 rpm. Assegurar que a temperatura é regulada para 37 °C e que o filtro do balão é selado com película de laboratório para evitar a evaporação do CO2.
- No dia seguinte, aspirar o meio e adicionar 10 mL de meio de cultura fresco reabastecido com 20 μM de citosina-1-β-D-arabinofuranosídeo (AraC) para eliminar as células em divisão residuais.
NOTA: a incubação com AraC por 2 - 3 dias na incubadora a 37 °C, 6% de CO2 resultará em uma cultura de astrócitos puros.
- Monitore a pureza das culturas de astrócitos por inspeção visual sob o microscópio óptico. Se as células progenitoras brilhantes de contraste de fase residual e a microglia ainda residirem no topo da monocamada astrocítica (consulte a etapa 1.16), repita as etapas 1.18 e 1.19.
NOTA: As monocamadas de astrócitos confluentes e puros podem ser mantidas por até 14 dias na incubadora (37 °C, 6% v/v CO2) antes de prosseguir para a próxima etapa. Troque metade do meio a cada 3 d. Não colete, congele e descongele os astrócitos, pois essas células perderão suas propriedades de suporte neuronal durante o procedimento de armazenamento.
2. Preparando astrócitos para a cocultura indireta
NOTA: 48 - 72 h antes de preparar os neurônios, transfira os astrócitos para as inserções de cultura de células. Geralmente, um único frasco T75 fornece um número suficiente de células para suportar as culturas neuronais obtidas com uma preparação.
- Coloque quantas inserções forem necessárias em placas de 24 poços. Cubra cada inserto com 10 μg/mL de PDL (dissolvido em água de grau de cultura de células) por cerca de 1 h a 37 °C, 6% v/v CO2. Após a incubação, lave as inserções duas vezes com PBS. Enquanto isso, prossiga com a preparação dos astrócitos.
NOTA: As inserções preenchidas com PBS podem ser mantidas até que a suspensão de células de astrócitos esteja pronta para uso.
- Aspire o meio astrócitos (com AraC) e lave a cultura uma vez com 10 mL de PBS para garantir que qualquer soro residual seja removido.
- Adicione 3 mL de tripsina-EDTA a 0,05% (ácido etilenodiaminotetracético) aos frascos e incube as células para tripsinização a 37 °C, 6% v/v CO2 por aproximadamente 10 min.
- Controle o descolamento celular por inspeção visual usando um microscópio e facilite o desprendimento das células batendo a lateral dos frascos contra a mesa.
NOTA: As etapas 2.5 a 2.8 são críticas e devem ser concluídas dentro de 15 a 20 min.
- Após a tripsinização, ressuspenda suavemente as células em meio de astrócitos de 7 mL e transfira a suspensão celular para um tubo de 15 mL. Centrifugue por 5 min a 216 x g.
- Aspire cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em meio de astrócitos de 1 mL.
- Conte as células usando uma câmara de contagem.
- Encha o fundo dos poços da placa de 24 poços com 500 μL de meio de astrócitos e transfira 25.000 células em meio de astrócitos de 500 μL para cada inserção individual. Incubar a cultura a 37 °C, 6% v/v CO2.
NOTA: Após 42 - 72 h as culturas atingirão aproximadamente 100% de confluência. Nesta fase, a pureza da cultura pode ser verificada por imunocitoquímica. As culturas confluentes podem ser mantidas por até 7 dias até prosseguir para a próxima etapa. Troque metade do meio a cada 3 dias.
3. Preparação de neurônios primários do hipocampo
NOTA: Os neurônios primários do hipocampo de camundongos devem ser derivados de embriões E15.5 - E16 de camundongos prenhes cronometrados.
- Prepare o meio neurônio (MEM com piruvato de sódio 10 mM, ovalbumina a 0,1% p/v, suplemento de meio B27 a 2% v/v e gentamicina a 0,1% v/v (filtrado estéril)) e meio de preparação (HBSS com glicose a 0,6% p/v e HEPES 10mM (ácido etanossulfônico 4-(2-hidroxietil)-1-piperazina)). Pré-aquecer e pré-equilibrar o meio dos neurónios em frascos filtrantes a 37 °C, 6% v/v CO2.
- Colocar as lamínulas de vidro (12 mm de diâmetro) nos poços das placas de 24 poços (utilizar as lamínulas especiais, que são entalhadas para utilização com insertos de cultura de células).
- Cubra por pelo menos 1 h com 15 μg/mL de poli-DL-ornitina em água (grau de cultura de células) a 37 °C. Use pelo menos 500 μL por poço para garantir que as lamínulas estejam completamente cobertas. Lave os poços duas vezes com PBS. Deixe o PBS nos poços até o revestimento das células. Certifique-se de que os poços não sequem.
- Para dissecar o hipocampo, prepare 3 pratos de 10 cm cheios de meio de preparação e 1 tubo de 2 mL com 1 mL de meio de preparação. Prepare uma tesoura e 2 pinças finas.
- Sacrifique a rata grávida por luxação cervical, esterilize o abdômen lavando com etanol 70% v / v e abra o abdômen usando uma tesoura afiada. Extirpar cuidadosamente o útero frisado com uma tesoura e transferir o órgão para um prato de 1 x 10 cm cheio de meio de preparação.
- Em seguida, remova os embriões do útero. Incie cuidadosamente o útero e remova o âmnio sem prejudicar os embriões usando 2 pinças. Em seguida, decapitar cada embrião com uma tesoura e transferir as cabeças para uma segunda placa de 10 cm fornecida com meio de preparação.
- Proceder à preparação das cabeças (semelhante à preparação descrita em 1.4 - 1.7).
- Imobilize a cabeça com um par de pinças e faça uma incisão no crânio e na pele na região do pescoço perto do rombencéfalo, perpendicular ao neuroeixo. Use um segundo par de pinças para levantar o crânio e cobrir a pele e dobre a calota craniana macia em direção à extremidade rostral da cabeça, expondo assim o cérebro.
- Com a ajuda de 2 pinças, desconecte o cérebro da cavidade craniana. Para fazer isso, feche 1 par de pinças e separe o cérebro do crânio começando nos bulbos olfatórios e movendo-se em direção ao rombencéfalo. Reúna os cérebros em outro prato de 10 cm cheio de meio de preparação.
- Disseque o hipocampo das porções do córtex conforme descrito acima para a preparação do astrócitos (etapa 1.6). Remova os hipocampos de cada hemisfério e colete-os no tubo de 2 mL cheio de meio de preparação.
- Após completar a dissecção, transfira o tubo para a bancada de fluxo laminar estéril e digere o tecido hipocampal com 1 mL de solução de digestão contendo papaína. Prepare a solução de digestão conforme descrito nas etapas 1.9 - 1.10, mas use MEM em vez de DMEM.
NOTA: As etapas 3.9 a 3.12 são críticas e devem ser concluídas dentro de 10 a 15 minutos.
- Após a conclusão da digestão, retire cuidadosamente a solução de digestão por sucção suave com uma pipeta.
- Lave o hipocampo 3 vezes com meio neural, adicionando sequencialmente e, em seguida, aspirando cuidadosamente 1 mL de meio de cultura fresco por ciclo de lavagem. Não centrifugue a suspensão celular.
- Após a etapa final de lavagem, triture cuidadosamente o tecido em meio de neurônio de 1 mL.
- Contar as células usando uma câmara de contagem e colocar 35.000 células em meio neural de 500 μL por um único poço de uma placa de 24 poços (a placa mencionada em 3.2).
NOTA: Opcionalmente, uma alíquota celular pode ser contracorada com azul de tripano para avaliar a vitalidade da preparação celular. Controle a densidade de revestimento por inspeção visual usando o microscópio (normalmente 90 - 110 células por campo visual de uma objetiva padrão de 10X).
- Coloque os neurônios na incubadora a 37 °C, 6% v/v CO2 por 1 h.
- Após a incubação, retire as inserções preparadas (semeadas com monocamadas de astrócitos confluentes) da incubadora (consulte a etapa 2.8). Troque o meio aspirando o meio astrócitos e substituindo-o por 500 μl de meio neurônio fresco.
NOTA: As inserções devem abrigar monocamadas de astrócitos confluentes após 2 a 3 DIV (Dias In Vitro).
- Coloque as inserções com astrócitos cuidadosamente nos poços que contêm as culturas de neurônios (etapa 3.13) usando uma pinça estéril.
- Coloque a co-cultura indireta de neurônio-astrócitos resultante de volta na incubadora a 37 ° C, 6% v / v CO2.
NOTA: Nessas condições, os neurônios podem ser cultivados por até 4 semanas em um meio completamente definido. Nenhuma mudança de mídia é necessária. Para culturas de longa duração, recomenda-se encher os poços vazios com água estéril para reduzir a evaporação da placa de 24 poços.
