Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.
1. Dissecção do cérebro de rato ou camundongo
NOTA: Podem ser utilizados ratinhos e ratos. Animais com mais de P8 também podem ser usados (testamos até P12), mas a remoção das meninges se tornará cada vez mais difícil. Além disso, o rendimento e a saúde celular diminuirão, uma vez que as células cerebrais de animais mais velhos terão formado processos e conexões intrincados que podem se romper durante a dissociação do tecido, levando ao aumento da morte celular. As preparações corticais são descritas aqui, mas outras regiões do cérebro também podem ser usadas.
- Colocar 0,05% de tripsina-EDTA num banho-maria a 37 °C.
- Eutanásia de animais (ratos prenhes para filhotes E19 ou animais P0-P8) aumentando lentamente a concentração de CO2 e isolando os cérebros. As etapas a seguir requerem uma técnica estéril.
- Se estiver trabalhando com tecido embrionário, primeiro remova os embriões do útero e abra os sacos embrionários, depois corte imediatamente as cabeças com uma tesoura. Quando todas as cabeças estiverem cortadas, transfira-as para um meio de dissecção pré-resfriado.
- Uma vez que as cabeças estejam submersas no meio, abra a pele e o crânio (ambos são muito macios em animais jovens) com uma pinça e retire o cerebelo. Cuidadosamente alavancar o resto do cérebro para cima e para fora do crânio.
nota: Dois a quatro embriões E19 produzem tecido suficiente para pelo menos oito placas de 10 cm de astrócitos corticais plaqueados a 500.000 células por placa no dia da dissecação.
- Para filhotes recém-nascidos ou mais velhos, corte as cabeças com uma tesoura e isole os cérebros cortando medialmente a pele em linha reta da parte de trás da cabeça até a ponta do nariz. Puxe a pele para o lado e corte cuidadosamente o crânio para a esquerda e para a direita, depois levante o osso do crânio. Corte o cerebelo e alavanque o resto do cérebro para cima e para fora do crânio.
nota: Dois a três filhotes P0-P8 produzem tecido suficiente para pelo menos oito pratos de 10 cm de astrócitos corticais plaqueados a 500.000 células por prato no dia da dissecação.
- Separe o córtex da estrutura subjacente do mesencéfalo. Coloque a pinça dentro da fissura longitudinal entre os hemisférios e, em seguida, mova a pinça entre as estruturas do córtex e do mesencéfalo de um hemisfério (perpendicular à fissura longitudinal) para libertar cada hemisfério.
- Usando a pinça, remova todas as meninges de cada hemisfério (e seu hipocampo) e, em seguida, separe o hipocampo. Se forem necessários astrócitos do hipocampo, mova cada hipocampo para um tubo de 15 mL cheio de 14 mL de meio de dissecção no gelo.
- Remova outras áreas do córtex de cada hemisfério se regiões específicas forem necessárias (por exemplo, córtex frontal). Corte qualquer tecido cortical a ser usado para gerar astrócitos em pedaços não maiores que 1 mm3. Colete todos os pedaços de tecido cortical em um tubo separado de 15 mL cheio de um meio de dissecção no gelo.
2. Digestão e dissociação de tecidos
- Depois que todos os pedaços de tecido forem coletados, espere que eles se depositem no fundo do tubo e, em seguida, aspire o máximo de meio possível.
- Adicione 2-3 mL de tripsina-EDTA a 0,05% usando uma pipeta sorológica e incube os tubos em banho-maria a 37 °C por 20 min.
nota: Libere toda a tripsina-EDTA da pipeta rapidamente para misturar os pedaços de tecido e deixá-los assentar novamente.
- Aspire cuidadosamente a tripsina-EDTA, deixando pedaços de tecido no mínimo de líquido possível, no fundo do tubo.
- Adicione 5 mL de meio de dissecção pré-resfriado para lavar a tripsina-EDTA restante. Pipete para o lado da parte superior do tubo para obter a mistura dos pedaços de tecido.
- Aspire o meio de dissecação e deixe os pedaços de tecido no mínimo de líquido possível. Repita esta etapa de lavagem com meio de dissecção pré-resfriado mais duas vezes.
- Após a etapa final de lavagem, adicione 1 mL de DMEM+ (aquecido à temperatura ambiente) usando uma ponta de pipeta de 1.000 μL e triture o tecido pipetando para cima e para baixo sem introduzir bolhas.
nota: É importante evitar a produção de bolhas, pois isso pode alterar o pH da solução, ao qual os astrócitos são bastante sensíveis.
- Coloque um filtro de células de 100 μm na abertura de um tubo de 50 mL e pré-umedeça o filtro com 4.5 mL de DMEM+ pré-resfriado.
- Pipete 1 mL de suspensão de tecido dissociado no filtro de células e adicione mais 4,5 mL de DMEM+ pré-resfriado para lavar as células através do filtro de células.
3. Células de passagem
- No dia anterior à passagem, cubra as placas de cultura de células com 0,04% de PEI.
- No dia in vitro (DIV) 7 após a dissecção, coloque as placas de 10 cm com células em DMEM+ em um agitador de laboratório na incubadora e agite as placas a 110 rpm por 6 h.
- Lave o PEI das lamínulas revestidas com água destilada e deionizada duas vezes. Adicione meio NB+H às placas (500 μL por poço para placas de 24 poços e 2 mL por poço para placas de 6 poços). Pré-equilibre as placas na incubadora a 37 °C e 5% de CO2 enquanto as placas de 10 cm estão tremendo, ou por pelo menos 30 min.
- 20-30 min antes do final da agitação de 6 h, pré-aqueça 1x PBS, DMEM+, NB+H e 0,25% de tripsina-EDTA a 37 °C no banho-maria.
- Após 6 h de agitação, retire as placas de cultura do shaker e substitua imediatamente o meio (que contém neurônios, oligodendrócitos e microglia sacudidos) por 10 mL de PBS pré-aquecido 1x por prato.
nota: É importante aspirar imediatamente o meio antigo contendo células destacadas para evitar que as células não astrocíticas se reconectem.
- Remova o PBS e adicione 3 mL de tripsina-EDTA pré-aquecido por prato. Incubar cada placa durante 4 min na incubadora a 37 °C e 5% de CO2
- Adicione 5 mL de DMEM+ pré-aquecido aos 3 mL de tripsina-EDTA em cada prato, pipete as células do prato usando uma pipeta sorológica de 5 mL e colete a suspensão celular em um tubo de 50 mL.
nota: Pipete diretamente do fundo do prato - o chão do prato deve ficar mais claro à medida que as células se desprendem. Use apenas meio contendo soro (no lugar de DMEM+), pois o soro inativa a tripsina.
- Centrifugar a suspensão da célula a 3.220 x g a 20 °C durante 4 min.
- Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 1 mL de NB + H pré-aquecido.
4. Revestimento Celular para Culturas Finais de Astrócitos
- Conte as células.
- Placa de 20.000 células por poço em placas de 6 poços (em meio NB+H de 2 mL por poço) ou 5.000 células por poço em placas de 24 poços (em meio NB+H de 500 μL por poço).
- Manter as culturas de células na incubadora a 37 °C e 5% de CO2 até tratamento ou análise posterior.
