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Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.
1. Diferenciação de hiPSCs positivos para rtTA/Ngn2 em neurônios em MEAs de 6 poços e lamínulas de vidro
NOTA: Neste protocolo, são fornecidos os detalhes para diferenciar hiPSCs positivos para rtTA/Ngn2 em dois substratos diferentes, ou seja, MEAs de 6 poços (dispositivos compostos por 6 poços independentes com 9 microeletrodos embutidos de gravação e 1 de referência por poço) e lamínulas de vidro nos poços de uma placa de 24 poços. Os protocolos, no entanto, podem ser facilmente adaptados para substratos maiores (por exemplo, para os poços de placas de 12 ou 6 poços), aumentando os valores mencionados de acordo com a área de superfície.
- Prepare os MEAs ou lamínulas de vidro (dia 0 e dia 1)
- No dia anterior ao início da diferenciação, esterilize os MEAs de acordo com a recomendação do fabricante.
- Diluir a proteína de adesão Poli-L-Ornitina (OLP) em água ultrapura estéril até uma concentração final de 50 μg/ml. Cubra a área do eletrodo ativo de MEAs de 6 poços colocando uma gota de 100 μL do PLO diluído em cada poço. Coloque as lamínulas nos poços da placa de 24 poços usando uma pinça estéril. Adicione 800 μL do PLO diluído em cada poço. Evite que as lamínulas flutuem empurrando-as para baixo com a ponta da pipeta de 1000 μL.
- Incube os MEAs de 6 poços e o O/N da placa de 24 poços em uma incubadora umidificada a 37 °C com uma atmosfera de 5% de CO2. No dia seguinte, aspire o OLP diluído. Lave as superfícies de vidro dos MEAs de 6 poços e as lamínulas duas vezes com água ultrapura estéril.
- Diluir a laminina em DMEM/F12 frio até uma concentração final de 20 μg/ml (para os MEAs de 6 poços) e 10 μg/ml (para as lamínulas de vidro). Cubra imediatamente a área do eletrodo ativo dos MEAs de 6 poços, colocando uma gota de 100 μL em cada poço. Da mesma forma, adicione 400 μL da laminina diluída em cada poço da placa de 24 poços para revestir as lamínulas. Evite que as lamínulas flutuem empurrando-as para baixo com a ponta da pipeta de 1.000 μL.
- Incube os MEAs de 6 poços e a placa de 24 poços em uma incubadora umidificada a 37 ° C com uma atmosfera de 5% de CO2 por pelo menos 2 h.
- Placa os hiPSCs (dia 1)
NOTA: Os volumes mencionados nas etapas 3.2.1 a 3.2.4 pressupõem que os hiPSCs positivos para rtTA/Ngn2 são cultivados em uma placa de 6 poços e que as células de um poço são colhidas. Os volumes necessários para o revestimento das células nos MEAs de 6 poços e/ou nas lamínulas dependem do número de MEAs de 6 poços e/ou do número de lamínulas usadas no experimento; Os números especificados nas etapas 3.2.6 a 3.2.8 permitem o dimensionamento para diferentes tamanhos de experimento.
- Aqueça o meio DMEM/F12, CDS e E8 com 1% (v/v) de penicilina/estreptomicina a R/T. Adicione doxiciclina a uma concentração final de 4 μg/mL e inibidor de ROCK ao meio E8.
- Aspire o meio gasto dos hiPSCs positivos para rtTA/Ngn2 e adicione 1 mL de CDS aos hiPSCs. Incubar 3 - 5 min em uma incubadora umidificada a 37 °C com uma atmosfera de 5% de CO2. Verifique ao microscópio se as células estão se desprendendo umas das outras.
- Adicione 2 mL de DMEM/F12 no poço, suspenda suavemente as células com uma pipeta de 1.000 μL e transfira as células para um tubo de 15 mL. Adicione 7 mL de DMEM/F12 à suspensão celular. Gire as células a 200 x g por 5 min.
- Aspirar o sobrenadante e adicionar 2 ml do meio E8 preparado. Dissocie as hiPSCs colocando a ponta de uma pipeta de 1.000 μL contra a lateral do tubo de 15 mL e ressuspendendo as células suavemente. Verifique ao microscópio se as células estão dissociadas.
- Determine o número de células (células/mL) usando uma câmara de hemocitômetro.
nota: Um poço de placa de 6 poços com 80 - 90% de confluência normalmente produzirá 3,0 - 4,0 x 106 células no total.
- Aspirar a laminina diluída. Para os MEAs de 6 poços, dilua as células para obter uma suspensão celular de 7,5 x 105 células/mL. Plaquear as células adicionando uma gota de 100 μL da suspensão celular na área do eletrodo ativo em cada poço dos MEAs de 6 poços. Para as lamínulas, diluir as células para obter uma suspensão celular de 4,0 x 104 células/mL. Plaquear as células adicionando 500 μL da suspensão celular aos poços da placa de 24 poços.
nota: A densidade celular final nos MEAs é maior do que nas lamínulas (Figura 1A e B). Descobrimos que essa alta densidade de células era necessária para registrar adequadamente a atividade da rede. No protocolo, são fornecidos os números ideais para os ensaios.
- Coloque os MEAs de 6 poços e a placa de 24 poços em uma incubadora umidificada a 37 ° C com uma atmosfera de 5% de CO2 por 2 h (MEAs) ou O/N (placa de 24 poços).
- Após 2 h, adicione cuidadosamente 500 μL do meio E8 preparado a cada poço dos MEAs de 6 poços. Coloque os MEAs O/N de 6 poços em uma incubadora umidificada a 37 °C com uma atmosfera de 5% de CO2.
- Alterar o meio (dia 2)
- No dia seguinte, prepare DMEM/F12 com suplemento N-2 a 1% (v/v), aminoácidos não essenciais a 1% (v/v) e penicilina/estreptomicina. Adicione neurotrofina-3 recombinante humana (NT-3) a uma concentração final de 10 ng/mL, fator neurotrófico derivado do cérebro recombinante humano (BDNF) a uma concentração final de 10 ng/mL e doxiciclina a uma concentração final de 4 μg/mL. Aquecer o médio a 37 °C.
- Adicione laminina a uma concentração final de 0,2 μg / mL ao meio. Filtre o meio resultante. Aspire o meio gasto dos poços dos MEAs de 6 poços e da placa de 24 poços e substitua-o pelo meio preparado. Incube os MEAs de 6 poços e o O/N da placa de 24 poços em uma incubadora umidificada a 37 °C com uma atmosfera de 5% de CO2.
- Adicionar astrócitos de rato (dia 3)
NOTA: Os volumes mencionados neste protocolo assumem que os astrócitos de ratos são cultivados em frascos de cultura T75. É fundamental que os astrócitos de ratos adicionados às culturas sejam de boa qualidade. Usamos dois critérios para verificar se os astrócitos de ratos são de boa qualidade. Primeiro, a cultura de astrócitos de ratos deve ser capaz de crescer confluente dentro de dez dias após o isolamento dos cérebros embrionários de ratos. Em segundo lugar, depois de dividir a cultura de astrócitos de ratos, os astrócitos de ratos devem ser capazes de formar uma monocamada confluente e tesselada (Figura 1C). Se a cultura de astrócitos de ratos não atender a esses dois critérios, aconselhamos não usar essa cultura para experimentos de diferenciação.
- Aqueça 0,05% de tripsina-EDTA a RT. Aqueça o DPBS e o DMEM/F12 com 1% (v/v) de penicilina/estreptomicina a 37 °C.
- Aspire o meio gasto da cultura de astrócitos de ratos. Lave a cultura adicionando 5 mL de DPBS e agite-a suavemente.
- Aspire o DPBS e adicione 5 mL de tripsina-EDTA a 0,05%. Agite a tripsina-EDTA suavemente. Incubar em uma incubadora umidificada a 37 °C com uma atmosfera de 5% de CO2 por 5 a 10 min.
- Verifique ao microscópio se as células estão separadas. Separe as últimas células batendo no frasco algumas vezes.
- Adicionar 5 ml de DMEM/F12 ao balão. Triturar as células suavemente dentro do frasco com uma pipeta de 10 mL. Recolha a suspensão celular num tubo de 15 ml. Gire o tubo a 200 x g por 8 min.
- Aspire o sobrenadante e ressuspenda as células em 1 mL de DMEM/F12. Determine o número de células (células/mL) usando uma câmara de hemocitômetro.
- Adicione 7,5 x 104 astrócitos por poço dos MEAs de 6 poços. Adicione 2,0 x 104 astrócitos por poço da placa de 24 poços. Incubar os MEAs e o O/N da placa de 24 poços em uma incubadora umidificada a 37 °C com uma atmosfera de 5% de CO2.
- Alterar o meio (dia 4)
- Prepare o meio neurobasal com 2% (v / v) de suplemento de B-27, 1% (v / v) de L-alanil-L-glutamina e 1% (v / v) de penicilina / estreptomicina. Adicione NT-3 a uma concentração final de 10 ng / mL, BDNF a uma concentração final de 10 ng / mL e doxiciclina a uma concentração final de 4 μg / mL. Além disso, adicione citosina β-D-arabinofuranosídeo a uma concentração de 2 μM.
NOTA: A citosina β-D-arabinofuranosídeo é adicionada ao meio para inibir a proliferação de astrócitos e matar os hiPSCs restantes que não estão se diferenciando em neurônios.
- Filtrar o meio e aquecer a 37 °C. Aspirar o meio gasto dos alvéolos dos MEAs de 6 poços e da placa de 24 poços e substituí-lo pelo meio preparado. Mantenha os MEAs de 6 poços e a placa de 24 poços em uma incubadora umidificada a 37 ° C com uma atmosfera de 5% de CO2.
- Atualize o meio (dia 6 - 28)
NOTA: A partir do dia 6, atualize metade do meio a cada dois dias. A partir do dia 10, o meio é suplementado com FBS para apoiar a viabilidade dos astrócitos.
- Prepare o meio neurobasal com 2% (v/v) de suplemento de B-27, 1% (v/v) de L-alanil-L-glutamina e 1% (v/v) de penicilina/estreptomicina. Adicione NT-3 a uma concentração final de 10 ng / mL, BDNF a uma concentração final de 10 ng / mL e doxiciclina a uma concentração final de 4 μg / mL. A partir do dia 10, suplementar também o meio com 2,5% (v/v) de FBS. Filtrar o meio resultante e aquecê-lo a 37 °C.
- Remova metade do meio gasto dos poços dos MEAs de 6 poços e da placa de 24 poços usando uma pipeta de 1000 μL e substitua-o pelo meio preparado. Mantenha os MEAs de 6 poços e a placa de 24 poços em uma incubadora umidificada a 37 ° C com uma atmosfera de 5% de CO2.
