Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Preparação de bolas de neurônios como cultura de gotas suspensas (Dias in vitro (DIV) 0-3)
NOTA: Os procedimentos aqui descritos para a preparação da cultura de bola de neurônios são baseados no método relatado anteriormente pelo grupo de Sasaki com algumas modificações. Também adotamos vários procedimentos do método de Banker para cultura dissociada.
- Confirmando o seguinte antes de iniciar a dissecção
- Prepare todas as soluções necessárias e esterilize-as por autoclave/filtração com antecedência.
- Mantenha prontos todos os instrumentos e materiais a serem usados em cada etapa dessa cultura de neurônios corticais.
- Pulverize e limpe o gabinete de fluxo de ar laminar, a mesa de dissecação, a placa de platina do estereomicroscópio, a tesoura e a pinça com etanol a 70%.
- Eutanasiar o camundongo após a aplicação de CO2 e dissecar o abdômen para obter embriões E16.
- Remover os cérebros dos embriões cuidadosamente com a ajuda de pontas finas de pinças e transferi-los para placas de cultura de células de 60 mm contendo 4 mL de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfônico, solução salina tamponada HEPES (HBSS).
nota: O meio de dissecção HBSS contém 10 mM de HEPES (pH 7,4), 140 mM de cloreto de sódio (NaCl), 5,4 mM de cloreto de potássio (KCl), 1,09 mM de hidrogenofosfato dissódico (Na2HPO4), 1,1 mM de di-hidrogenofosfato de potássio (KH2PO4), 5,6 mM de D-glicose e 5,64 μM de vermelho de fenol.
- Remova o couro cabeludo, corte o bulbo olfatório, separe os córtices de cada hemisfério cerebral usando as pontas finas da pinça sob um estereomicroscópio e transfira para outro prato de 60 mm contendo HBSS fresco. Use pelo menos 3-5 embriões para cada cultura de bola de neurônios separada.
- Corte os córtices em pedaços pequenos com uma tesoura de mola de microdissecação em uma capa de cultura de células de fluxo laminar.
- Transferir os córtices picados para um tubo de 15 mL e tripsinizar os córtices picados em 4 mL de tripsina a 0,125% em HBSS por 4,5 min em banho-maria a 37 °C.
nota: Esse tempo de tripsinização é crítico para uma cultura eficiente de neurônios, pois o tempo crescente (> 4,5 min) leva a muito mais neurônios mortos.
- Transferir os agregados celulares para um novo tubo de 15 ml contendo 10 ml de HBSS por uma pipeta de transferência estéril e incubar a 37 °C durante 5 min. Repetir este passo mais uma vez.
- Transfira os agregados celulares para um novo tubo de 15 mL contendo 2 mL de meio neurobasal contendo GlutaMax, suplemento B27 (meio NGB), 0,01% de DNase I e 10% de soro de cavalo.
- Triturar os córtices tripsinizados pipetando-os repetidamente para cima e para baixo (3-5 vezes) usando uma pipeta Pasteur de vidro fino polido a fogo.
nota: O diâmetro de uma pipeta Pasteur de vidro fino polido a fogo é muito importante, conforme descrito no artigo do método Banker. Se a pipeta for muito estreita para passar córtices, prepare pipetas com 2-3 tamanhos diferentes e experimente uma pipeta maior.
- Para preparar bolas de neurônios, pegue a suspensão celular acima e ajuste a densidade celular para 1 x 106 células / mL usando um meio NGB.
- Cultive os neurônios corticais como gotas suspensas contendo 10.000 células/gota (1 gota é 10 μL) dentro das pálpebras superiores de placas de cultura de 10 cm.
- Adicione 7 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) na parte inferior das placas de cultura e mantenha em uma incubadora por 3 dias a 37 ° C com 5% de CO2 em condições umidificadas para permitir a formação de bolas de neurônios.
