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1. Preparação de cultura de neurônio do gânglio da raiz dorsal adulto dissociado ou neurônio DRG
- Antes de montar a cultura, pré-cubra uma placa de 6 poços com poli-D-lisina e laminina. Incube uma placa de 6 poços com 0,01% de poli-D-lisina a 37 ° C por 2 h ou a 4 ° C durante a noite. Em seguida, lave o prato duas vezes com água destilada.
- Incubar a placa com solução de laminina a uma concentração de 3 μg/ml durante 2 h à temperatura ambiente e, em seguida, lavar a placa duas vezes com água destilada. Seque a placa em temperatura ambiente por pelo menos 1 h.
- Eutanásia de um camundongo em uma câmara transparente de CO2 conectada a um cilindro de gás CO2 comprimido. Incisar a pele que cobre a coluna vertebral com uma lâmina cirúrgica e dissecar os músculos paravertebrais bilateralmente para expor os ossos vertebrais. Remova os ossos vertebrais meticulosamente usando um rongeur cirúrgico de ponta estreita até que os DRGs estejam totalmente expostos.
nota: Os neurônios DRG adultos são obtidos de camundongos machos C57BL6 adultos com idade entre 8 e 12 semanas.
- Remova os DRGs bilateralmente do S1 até o nível C1 usando tesoura de iridectomia e pinça de ponta fina sob um microscópio de dissecação. Tente cortar as raízes inteiramente dos DRGs para minimizar a contaminação das células de Schwann ou fibroblastos.
- Armazene os DRGs dissecados em uma placa de Petri de 60 mm contendo 5 mL de Meio de Eagle Modificado (DMEM) de Dulbecco frio em gelo até que todos os DRGs sejam o próximo passo, mesmo que ainda haja DRGs remanescentes sejam coletados.
nota: É fundamental dissecar os DRGs o mais rápido possível. A coleta de todos os DRGs de um camundongo não deve demorar mais de 30 min. 30 min após a eutanásia, pare de coletar os DRGs e prossiga para Transferir os DRGs para um tubo Eppendorf de 1,5 mL usando uma ponta de pipeta azul (1000 μL) com uma extremidade de corte. Remova o DMEM após uma centrifugação rápida por vários segundos usando uma mini centrífuga. Adicione 1 ml de DMEM contendo 125 U/ml de colagenase tipo XI e incube o tubo durante 90 min com uma rotação suave (35-40 rpm) utilizando um agitador twister numa incubadora a 37 °C. Imobilize o tubo no chão do agitador usando a fita.
- Descarte o DMEM contendo colagenase e adicione 1 mL de DMEM fresco. Espere até que os DRGs flutuantes afundem completamente no fundo e, em seguida, remova o DMEM com os detritos do tecido. Repita esta etapa de lavagem pelo menos seis vezes.
nota: Não tente descartar completamente o sobrenadante. Tenha cuidado para não remover nenhum DRG com o DMEM sobrenadante.
- Transfira os DRGs para um tubo cônico de 15 mL usando uma ponta de pipeta azul (1000 μL) com uma extremidade de corte. Em seguida, pipete para cima e para baixo suavemente pelo menos 15 vezes usando uma ponta azul (1000 μL) para fazer uma suspensão celular homogênea. Evite fazer bolhas e tente não tocar no fundo do tubo cônico com uma ponta de pipeta.
- Centrifugue o tubo a 239 x g por 3 min e descarte cuidadosamente o sobrenadante com detritos flutuantes. Adicione 1 mL de meio neurobasal suplementado com B27 (2,0% v / v) e ressuspenda o pellet celular pipetando suavemente para cima e para baixo 5 a 10 vezes.
- Passe a suspensão celular por um filtro de células de 70 μm sobreposto a um tubo cônico de 50 mL. Aguarde 2 min e, em seguida, despeje o meio Neurobasal/B-27 na peneira usando um controlador de pipeta.
- Coloque todos os neurônios DRG coletados (aproximadamente 2 x 106 neurônios DRG de um camundongo) em dois poços de placa de 6 poços. Os neurônios DRG de um camundongo adulto cobrem dois poços em uma placa de 6 poços. Em seguida, colocar a placa em uma incubadora de CO2 a 37°C até que os macrófagos co-cultivem.
2. Co-cultura de macrófagos peritoneais primários em um inserto de cultura de células
NOTA: Estabelecer as co-culturas 4 h após o plaqueamento inicial dos neurônios DRG dissociados
- Os macrófagos peritoneais primários são preparados a partir de camundongos machos C57BL6 adultos com idade entre 8 e 12 semanas. Eutanásia de um animal em uma câmara de CO2. Incise a pele abdominal delicadamente, exponha o peritônio e evite cortar o peritônio para evitar vazamento de fluido de lavagem.
- Puncione o peritônio usando uma seringa com uma agulha 22G e injete 10 mL de solução salina tamponada com fosfato gelado (PBS) na cavidade peritoneal. Massageie suavemente o peritônio por 1-2 min. Em seguida, retire a agulha e esprema o PBS através do local da punção da agulha e colete o fluido de lavagem em um tubo cônico de 50 mL.
nota: Antes de usar, coloque a seringa no gelo para manter o frio do PBS.
- Centrifugue o fluido de lavagem a 239 x g por 10 min a 4 ° C para granular os componentes celulares. Ressuspenda o pellet com 3 mL do tampão de lise dos glóbulos vermelhos (RBC) por 3 min em temperatura ambiente. Em seguida, centrifugue novamente a suspensão celular a 239 x g por 10 min a 4 °C. Ressuspenda o pellet com 3 mL de PBS e centrifugue novamente a suspensão celular para remover qualquer tampão de lise eritrocitário restante.
nota: Certifique-se de que o tampão de lise de hemácias esteja completamente removido. Caso contrário, o tampão de lise de hemácias remanescente pode ser tóxico para os macrófagos cultivados.
- Ressuspenda as células peletizadas em 1 mL de meio Neurobasal/B-27. Plaquear metade de todos os macrófagos coletados (um total de 3 × 106 a 6 x 106 células) em um inserto de cultura de células com uma área efetiva de 4,2 cm2, que é colocado no topo do poço de DRG.
dissociado
nota: Durante o período de co-cultura, os macrófagos são cultivados no meio de cultura de neurônios Neurobasal/B-27. A sobrevida adequada dos macrófagos nessa condição foi confirmada.
3. Tratamento de db-cAMP (AMP dibutiril-cíclico) e coleta de macrófagos CM
NOTA: Inicie o tratamento com db-cAMP 4 h após as co-culturas neurônio-macrófagos.
- Adicione 2 μL de solução de 100 μM db-cAMP às co-culturas neurônio-macrófagos. Adicione o mesmo volume de PBS para um experimento de controle.
- Após 24 h, encher um alvéolo vazio com 1 ml de meio de cultura de macrófagos na mesma placa de 6 poços. Transferir a inserção de cultura de células nas coculturas neurónio-macrófagos para o poço vazio com um meio de cultura de macrófagos. Mantenha as células sob a mesma condição por 72 horas sem alterar o meio.
nota: Adicionamos apenas 1 mL de meio de cultura de macrófagos durante a coleta de MC para fazer MC concentrado. Durante a coleta de MC, se necessário, adicionamos mais para cobrir completamente os macrófagos dentro da inserção.
- Após 72 h, centrifugue o macrófago CM a 239 x g por 5 min para remover os componentes celulares. Passe o sobrenadante por um filtro de 0,2 μm para remover quaisquer detritos celulares restantes. Conservar o CM recolhido a -70 °C até à utilização.