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1. Tratamento de Db-Camp e Coleta de Meio Condicionado de Macrófagos
NOTA: Inicie o tratamento com db-cAMP 4 h após as co-culturas neurônio-macrófagos.
- Adicione 2 μL de solução de 100 μM de AMP dibutiril cíclico (db-cAMP) às co-culturas neurônio-macrófagos. Adicione o mesmo volume de salin tamponada com fosfato (PBS) para um experimento de controle.
- Após 24 h, encher um alvéolo vazio com 1 ml de meio de cultura de macrófagos na mesma placa de 6 poços. Transfira a inserção da cultura de células nas co-culturas neurônio-macrófagos para o poço vazio com meio de cultura de macrófagos. Mantenha as células sob a mesma condição por 72 h sem alterar o meio.
nota: Adicionamos apenas 1 mL de meio de cultura de macrófagos durante a coleta do meio condicionado (MC) para fazer o MC concentrado. Durante a coleta de MC, se necessário, adicionamos mais para cobrir completamente os macrófagos dentro da inserção.
- Após 72 h, centrifugue o macrófago CM a 239 x g por 5 min para remover os componentes celulares. Passe o sobrenadante por um filtro de 0,2 μm para remover quaisquer detritos celulares restantes. Conservar o CM recolhido a -70 °C até à utilização.
2. Ensaio de crescimento de neurite com CM coletado
- Antes de configurar uma cultura de neurônios DRG adulta separada, pré-cubra uma lâmina de câmara de 8 poços com poli-D-lisina e laminina. Incube uma placa de 6 poços com 0,01% de poli-D-lisina a 37 ° C por 2 h ou a 4 ° C durante a noite. Em seguida, lave o prato duas vezes com água destilada.
- Incubar a placa com solução de laminina a uma concentração de 3 μg/ml durante 2 h à temperatura ambiente e, em seguida, lavar a placa duas vezes com água destilada. Seque a placa em temperatura ambiente por pelo menos 1 h.
- Obtenha neurônios DRG adultos dissociados em meio neurobasal suplementado com B27. Coloque 5 x 104 células por poço na lâmina da câmara pré-revestida de 8 poços.
- Coloque a lâmina da câmara em uma incubadora a 37 °C por 2 h, permitindo que as células se fixem ao fundo. Em seguida, substituir o meio de cultura pelo CM descongelado pré-aquecido a 37 °C.
nota: Tenha cuidado para não tocar no fundo da lâmina da câmara de 8 poços ao remover o meio de cultura e adicionar o CM coletado.
- 15 h após o plaqueamento inicial, remova o meio e lave as células com PBS uma vez. Em seguida, adicione 200 μL de solução gelada de paraformaldeído a 4% aos poços e incube as células com a solução de paraformaldeído por 20 min a 4 °C
nota: A cultura de neurônios DRG para ensaio de crescimento de neuritos deve ser precisamente restrita a 15 h. Sob esta condição, não há crescimento apreciável de neuritos.
- Lave três vezes com PBS gelado e, em seguida, execute o bloqueio com 10% de soro de cabra normal (NGS) com 0,1% de Triton-X por 30 min. Incube as células fixas com solução de anticorpo primário (anti-Tuj-1) diluída com 10% de NGS (na concentração de 1 μg / mL) por 4 h em temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C.
- Lavar três vezes com PBS e, em seguida, incubar as células com solução de anticorpo secundário (cabra-anti-ratinho) durante 2 h à temperatura ambiente. Em seguida, lave duas vezes com PBS e monte a lâmina de cultura com uma lamínula (24 × 50 mm) usando uma solução de montagem.
- Tire imagens usando um microscópio de fluorescência para visualizar o crescimento de neuritos (Figura 1).
