Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Câmara microfluídica ou preparação MFC
- Fundição PDMS em moldes primários (Figura 1)
- Compre ou crie moldes primários (wafers) seguindo um protocolo detalhado.
- Use ar pressurizado para remover qualquer tipo de sujeira da plataforma de wafer antes de prosseguir para a etapa de revestimento. A superfície das bolachas deve parecer lisa e clara.
- Encha um recipiente com 50 mL de nitrogênio líquido. Prepare uma seringa de 10 mL e agulha de 23 G.
nota: Todos os procedimentos a partir desta etapa devem ser realizados em uma coifa química.
- Na capa química, use a seringa e a agulha para acumular 2 mL de nitrogênio líquido. Embora possa parecer que o ar foi aspirado, a seringa está cheia de nitrogênio (Figura 1A). Coloque a placa contendo wafer em um recipiente lacrável.
- Abra um frasco de clorotrimetilsilano, fure a tampa de borracha usando a seringa cheia de nitrogênio e injete todo o conteúdo da seringa no frasco. Sem puxar a agulha, vire o frasco de cabeça para baixo e retire 2 mL de clorotrimetilsilano.
nota: Por causa da pressão da seringa, uma pequena quantidade de clorotrimetilsilano é pulverizada para fora da agulha. Para evitar um perigo, aponte a agulha para a parede interna do capô (Figura 1B).
- Espalhar o clorotrimetilsilano uniformemente no recipiente (a partir do passo 1.1.4), mas não directamente sobre o wafer ou a placa que contém o wafer. Feche o recipiente e incube por 5 min por wafer.
nota: Se esta for a primeira vez que o wafer é revestido com clorotrimetilsilano, deve ser permitida uma incubação de 1 h para cada wafer.
- Não retire os wafers e o recipiente da coifa química por 30 min.
cuidado: O clorotrimetilsilano é altamente volátil.
- Pese a base do PDMS (consulte a Tabela de Materiais) em um tubo de 50 mL e adicione o agente de cura PDMS na proporção de 16:1, respectivamente (por exemplo, 47,05 g de base e 2,95 g de agente de cura). Misture por 10 min usando um rotador de baixa velocidade.
- Despeje o PDMS em cada placa contendo wafer na altura desejada (Figura 1C).
nota: O uso de câmaras microfluídicas finas (até 3-4 mm) melhora a aderência à placa de cultura e evita vazamentos.
- Coloque todas as placas juntas dentro de um dessecador a vácuo por 2 h (Figura 1E). Este processo remove o ar preso dentro do PDMS, eliminando assim as bolhas de ar e formando um molde claro e uniforme.
- Coloque as placas dentro de um forno por 3 h (ou durante a noite) a 70 °C (Figura 1E).
nota: As placas devem estar niveladas quando colocadas no forno.
- Fundição PDMS em moldes epóxi
nota: Como a preparação do wafer é cara, requer equipamento especial e pode danificar os wafers frágeis, é possível gerar réplicas epóxi de wafers. As réplicas são mais baratas, mais duráveis e podem ser usadas para a produção em massa de câmaras microfluídicas.
- Fundir e polimerizar o PDMS (conforme descrito em 1.1.8-1.1.11) no wafer original.
- Remova e corte as partes excedentes do PDMS, deixando apenas os elementos microfluídicos e a área funcional necessária para processá-los em câmaras microfluídicas.
- Enrole imediatamente o PDMS com fita adesiva grossa para evitar que acumule poeira.
- Escolha um prato de plástico de grau de cultura de tecido que caiba em todo o PDMS interno e deixe espaço para epóxi ao seu redor. A distância do PDMS ao prato de plástico deve ser inferior a 5 mm.
- Prepare uma pequena quantidade de PDMS misturado na proporção de 10:1 (base: agente de cura). O PDMS líquido fresco será usado para colar o PDMS sólido na parte inferior da placa de plástico.
- Aplique uma quantidade mínima do PDMS líquido no fundo central da placa de plástico e, em seguida, remova a fita adesiva do PDMS e cole-a no fundo do prato de plástico. Certifique-se de que os elementos microfluídicos estejam voltados para cima.
- Deixe o PDMS curar por 30 min em um forno a 70 °C.
- Prepare a resina epóxi misturando a base e o agente de cura na proporção de 100:45, respectivamente, em um tubo de ensaio. Diferentes resinas epóxi podem ter diferentes proporções de mistura. O volume necessário para uma placa regular de 100 mm é de aproximadamente 40 mL.
- Deixe o epóxi misturar bem por 10 min em um rotador até que a mistura se torne visivelmente homogênea (ou seja, não há artefatos visíveis semelhantes a fibras no líquido).
- Centrifugue a mistura epóxi a 400 x g por 5 min para remover as bolhas de ar presas no interior.
- Durante a centrifugação, espalhe uma fina camada de graxa de silicone ao redor das paredes e todas as outras partes plásticas expostas da placa de cultura. Isso evitará que o epóxi polimerize com o plástico do prato e permitirá a remoção do epóxi curado facilmente no final do protocolo.
- Despeje o epóxi lentamente no prato até cobrir completamente o PDMS e ultrapassá-lo em pelo menos 5 mm. Evite a formação de bolhas dentro do epóxi mantendo distância zero entre o tubo e a placa. Coloque a placa em um local seguro para que não seja movida nas próximas 48 h.
- Após 48 h, o epóxi deve estar completamente curado. Insira a placa em um forno pré-aquecido a 80 °C por 3 h para cura final.
- Remova o epóxi curado da placa e o molde PDMS original puxando suavemente a parede de plástico da placa até que ela se quebre. Em seguida, deve separar-se facilmente do epóxi e descascar.
- Depois de extraída, limpe a graxa restante da nova réplica de epóxi e insira-a de cabeça para baixo (ou seja, com os elementos microfluídicos replicados voltados para cima) em uma nova placa de cultura. A réplica epóxi agora está pronta para fundição PDMS.
- Use ar pressurizado ou N2 para soprar quaisquer restos de PDMS ou sujeira do molde epóxi e enxágue-o 2x com isopropanol. Encha-o uma terceira vez e incube por 10 min em uma placa agitadora orbital. Enxágue o molde novamente 3x com isopropanol e descarte o líquido restante. Seque com ar ou N2 ou leve ao forno a 70 °C até secar.
nota: Siga os procedimentos de segurança ao trabalhar e descartar isopropanol.
- Mantenha as placas do molde fechadas até a fundição. Siga as etapas 1.1.8.-1.1.11.
- Perfurando e esculpindo o PDMS em um MFC (Figura 2)
- Corte e remova o molde PDMS da placa seguindo as marcas (+) nos wafers usando um bisturi. Não use força, pois os moldes são frágeis (Figura 2A).
- Siga as instruções desenhadas no esboço para perfurar e cortar as câmaras, dependendo da configuração experimental (Figura 2B-F).
- Para cultura de explante da medula espinhal ( Figura 2C, E ), perfure dois poços de 7 mm no lado distal do MFC grande. Localize os poços de forma que eles se sobreponham às bordas do canal. No lado proximal, perfure um poço de 7 mm no meio do canal, com sobreposição mínima, de modo que haja espaço suficiente para os explantes. Faça dois furos adicionais de 1 mm nas duas bordas do canal proximal. Gire o MFC com os elementos microfluídicos voltados para cima e, usando uma agulha de 20 G, esculpir três pequenas cavernas de explante no poço perfurado de 7 mm.
- Para cultura de MN dissociada (Figura 2D, F), perfure quatro poços de 6 mm nas bordas dos dois canais de um pequeno MFC.
- Esterilização do MFC para uso em cultura de tecidos
- Espalhe fitas adesivas de 50 cm de comprimento na bancada. Pressione e puxe a câmara para trás para enfrentar a fita adesiva (faces superior e inferior) e remover a sujeira bruta. Coloque as câmaras limpas em uma nova placa de 15 cm.
nota: Não pressione diretamente os elementos microfluídicos quando estes estiverem voltados para cima.
- Incubar as câmaras em etanol 70% de grau analítico por 10 min em um agitador orbital.
- Eliminar o etanol e secar as câmaras numa capa de cultura de tecidos ou numa estufa a 70 °C.
- Colocando o MFC em um prato com fundo de vidro
- Coloque a câmara no centro de um prato de fundo de vidro de 35 mm/50 mm de grau de cultura de tecidos e aplique uma pequena força nas bordas para fazer com que o PDMS e o fundo do prato se liguem. Para evitar quebrar o fundo do vidro, sempre aplique força em cima de uma superfície sólida.
- Incubar durante 10 min a 70 °C. Pressionar as câmaras para reforçar a aderência à placa.
- Incubar sob luz UV durante 10 min.
- Revestimento e cultura
- Adicione 1,5 ng/mL de poli-L-ornitina (PLO) a ambos os compartimentos. Certifique-se de que o PLO esteja passando pelos canais pipetando o meio de revestimento algumas vezes diretamente na entrada do canal.
- Examine a câmara microfluídica sob um microscópio óptico com ampliação de 10x para verificar a presença de bolhas de ar. Se bolhas de ar estiverem bloqueando as microranhuras, coloque o MFC em um dessecador a vácuo por 2 min. Mais tarde, remova o excesso de ar que ficou preso nos canais pipetando o meio de revestimento através deles. Incubar durante a noite.
- Substitua a PLO por laminina (3 μg / mL em DDW) para incubação durante a noite da mesma maneira.
- Antes do plaqueamento, lave a laminina com um meio de cultura neuronal.
2. Placa de cultura neuronal
- Cultura de explante de medula espinhal
- Usando uma tesoura reta e uma pinça fina, disseque uma medula espinhal de um embrião de camundongo E12.5 ICR-HB9:GFP. Trabalhe em uma solução 1X HBSS com penicilina-estreptomicina a 1% (P / S) ( Figura 3A-C ).
- Com uma tesoura de microdissecção, remova as meninges e os cornos dorsais (Figura 3D).
- Corte a medula espinhal em seções transversais de 1 mm de espessura (Figura 3E). Descarte todo o meio do compartimento proximal do MFC.
- Pegue um único explante da medula espinhal com uma pipeta em um volume total de 4 μL. Injete o explante o mais próximo possível da caverna e retire qualquer excesso de líquido do poço proximal através das saídas laterais (punções de 1 mm). Os explantes devem ser sugados para o canal proximal.
- Adicione lentamente 150 μL de meio de explante da medula espinhal (SCEX, consulte a Tabela de Materiais e a Tabela 3) ao poço proximal.
- Manutenção da cultura de explante da medula espinhal
- Adicione o meio SCEX no compartimento proximal e o meio SCEX rico (SCEX com 50 ng/mL de BDNF e GDNF) no compartimento distal. Manter um gradiente de volume de pelo menos 15 μL por alvéolo entre os poços distais (maior volume) e o poço proximal.
- Atualize o meio a cada 2 dias. Os axônios podem levar de 3 a 5 dias para cruzar distalmente.
3. Transporte axonal (Figura 4A)
- Marcação de mitocôndrias e compartimentos ácidos
- Prepare um meio SCEX fresco (ou CNB para MN dissociado) contendo 100 nM Mitotracker Deep Red FM e 100 nM LysoTracker Red. Incubar durante 30-60 min a 37 °C. Outras cores podem ser usadas, desde que seus fluoróforos não se sobreponham.
- Lave 3x com meio CNB/SCEX quente. As placas estão prontas para a obtenção de imagens.
- Imagens ao vivo
- Adquira 100 séries de imagens de lapso de tempo de transporte axonal em intervalos de 3 s, com um total de 5 min por filme.
nota: O sistema de imagem usado neste estudo incluiu um microscópio invertido equipado com disco giratório confocal, controlado por meio de software de imagem de célula proprietário, lente de óleo 60x, NA = 1,4 e uma câmera EMCCD. Os filmes foram adquiridos em ambiente controlado a 37 °C e 5% de CO2,
nota: Podem ser fotografadas filmagens time-lapse mais longas ou mais curtas, dependendo da experiência. Mesmo filmes noturnos podem ser gravados, se necessário. No entanto, é fundamental tentar reduzir o tempo de exposição e a potência do laser, bem como o número total de imagens, para diminuir a fototoxicidade e o branqueamento durante a aquisição do filme.
