Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Preparação de materiais
- Esterilize todos os instrumentos e ddH2O usando uma autoclave antes de realizar o experimento. Os instrumentos incluem, entre outros, tesouras cirúrgicas, tesouras oftálmicas, pinças, colheres, divisor de núcleo, pratos de vidro (60 a 100 mm de diâmetro) e copos de vidro.
- Preparar a solução de Krebs (Tabela 1): Dissolver todos os produtos químicos com ddH2O antes de utilizar. Dissolver o CaCI2 separadamente e adicionar lentamente à solução misturada, mexendo para evitar sedimentos.
- Prepare o meio de enxágue, que consiste em meio F12 com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de antibiótico/antimicótico (100x). Adicione 5 mL de FBS e 0,5 mL de antibiótico/antimicótico a 44,5 mL de meio F12.
- Prepare o meio neuronal A, que compreende o meio neurobasal A com 2% de B-27, 1% de FBS, 1% de L-glutamina, 1% de antibiótico/antimicótico (100x) e 0,1% de fator neurotrófico derivado da glia (GDNF). Adicionar 200 μL de B-27, 100 μL de FBS, 100 μL de L-glutamina, 100 μL de antibiótico/antimicótico (100x) e 10 μL de GDNF (10 μg/mL) a 9,5 mL de meio A neurobasal.
nota: Prepare o meio neural A dentro de uma semana após o uso para garantir o frescor de B-27, L-glutamina e GDNF.
- Prepare o meio do neurônio B usando o mesmo procedimento da preparação do meio do neurônio A, mas sem adicionar FBS.
- Prepare a solução de digestão 1 dissolvendo 20 mg de colagenase tipo II, 6 mg de albumina de soro bovino e 200 μL de antibiótico/antimicótico (100x) em 10 mL de solução de Krebs estável ao oxigênio.
- Prepare a solução de digestão 2 diluindo 1 mL de tripsina a 0,25% com 4 mL de solução salina balanceada de Hank.
- Prepare um prato com lamínulas revestidas.
- Use uma pinça em uma bancada de fluxo laminar ao colocar lamínulas de vidro em uma placa de cultura de 48 poços.
- Diluir a poli-D-lisina com ddH2O até uma concentração de 0,1 mg/ml sob a forma de massa de poli-D-lisina. Armazene o estoque a –20 °C e descongele antes
- Adicione 40 μL de caldo de poli-D-lisina em cima de cada lamínula e incube a solução em temperatura ambiente por 10 min.
nota: Ajustar a concentração a 4 μg/cm2 para diferentes placas com diferentes áreas basais. Por exemplo, se a área basal de um poço de uma placa de 24 poços for de 2 cm2, devemos transferir 80 μL de estoque de poli-D-lisina em um poço. Cada cm2 conteria 4 μg de poli-D-lisina.
- Remova a poli-D-lisina na placa de 48 poços e enxágue as lamínulas com ddH2O três vezes.
- Seque a placa em uma capela de fluxo laminar por pelo menos 30 min para garantir que a placa seja anidra.
- Armazene a placa a 4 ° C antes do revestimento da laminina por 1 dia no máximo. Armazenar a placa a -20 °C é preferível para armazenamento de longo prazo.
- Descongelar a laminina a 4 °C. Diluir a laminina com ddH2O até uma concentração de 50 μg/ml sob a forma de depósito de laminina. Armazene o estoque a –20 °C e descongele a 4 °C antes de usar.
- Use uma pipeta para transferir 100 μL de laminina diluída para o topo de cada lamínula e incubar a laminina a 4 ° C por 1 h.
nota: Ajustar a concentração a 5 μg/cm2 para diferentes placas com diferentes áreas basais. Por exemplo, se a área basal de um poço de uma placa de 24 poços for de 2 cm2, transfira 200 μL de laminina diluída para um poço. Cada cm2 conteria 5 μg de laminina.
- Remova a solução de laminina e lave as lamínulas com ddH2O uma vez. Execute esta operação na borda da lamínula para evitar raspagem.
nota: As lamínulas revestidas podem ser armazenadas a 4 °C durante um máximo de 2 semanas.
2. Colheita da bexiga
- Obtenha ratos Sprague-Dawley de cinco semanas de idade.
- Infundir carbogênio (95% de oxigênio, 5% de CO2) na solução de Krebs por pelo menos 30 min em um banho de gelo para atingir um estado estável de oxigênio e nível de pH.
- Após a eutanásia por luxação cervical, mergulhe os ratos em etanol a 75% por 30 s para esterilização.
- Coloque os ratos em uma toalha cirúrgica esterilizada e exponha seu abdômen. Abra a cavidade abdominal e revele a bexiga com um conjunto de tesouras e pinças.
- Levante a bexiga suavemente e corte-a do colo da bexiga com outro conjunto de tesouras e pinças para evitar contaminação cruzada. Coloque a bexiga rapidamente em uma solução de Krebs fria e estável ao oxigênio para melhorar a sobrevivência celular.
nota: Depois que a bexiga for removida, execute as seguintes operações rapidamente para melhorar a perspectiva de sobrevivência dos neurônios.
- Adicione a solução de Krebs em três pratos de vidro e copos de vidro.
- Prepare pratos de vidro e copos com solução de Krebs em banho de gelo para pré-resfriamento.
- Marque esses recipientes com os números de 1 a 3 correspondentemente para evitar confusão.
- Combine cada prato de vidro com uma pinça e um divisor de núcleo de colheres.
- No prato de vidro 1, abra a bexiga com uma tesoura oftálmica e desdobre-a com uma pinça e uma colher divisor de núcleo.
- Lave a bexiga no copo de vidro 1 e coloque-a no prato de vidro 2.
- Elimine a gordura aderente na superfície do tecido usando fórceps e tesoura oftálmica em uma placa de vidro 2.
- Lave a bexiga no copo de vidro 2 e coloque-a no prato de vidro 3.
- Raspe suavemente a bexiga usando a pinça e o divisor de núcleo da colher no prato de vidro 3 para remover os anexos exógenos.
- Lave a bexiga em um copo de vidro 3, transfira a bexiga para um tubo de centrífuga de 15 mL com 14 mL de solução fria de Krebs e gire a amostra por 1 min a 356 x g e 4 ° C.
- Repita a etapa anterior duas vezes em dois outros tubos com solução de Krebs para reduzir a contaminação.
3. Digestão da bexiga em duas etapas
- Transfira a bexiga do tubo da centrífuga para um frasco de 2 mL contendo 1 mL de solução de digestão 1. Use uma tesoura oftálmica para cortar a bexiga em pedaços pequenos (menores que 1 mm) em solução.
- Misture a solução da bexiga com 9 ml da solução de digestão 1 numa placa de cultura de células estéril (100 mm de diâmetro). Realize a digestão da etapa 1 em uma incubadora agitada por 1 h sob 5% de CO2, 37 ° C e 200 rpm.
- Após a digestão do passo 1, centrifugue a solução a 356 x g a 4 °C durante 8 min.
- Colocar a solução de digestão 2 num banho-maria a 37 °C para pré-aquecimento.
- Após centrifugação, remover o sobrenadante que contém a solução de digestão 1 e colher o sedimento celular. Algum líquido restante é permitido. A remoção completa da solução pode promover a perda celular.
- Misturar o sedimento celular com a solução de digestão quente 2 num tubo de centrifugação de 15 ml e agitar a mistura durante a digestão num banho-maria a 37 °C durante 5 min. Não exceda 7 min da etapa 2 da digestão, ou os neurônios perecerão.
- Após a digestão, desative imediatamente a tripsina na mistura com 10 mL de meio de enxágue frio.
nota: Execute as etapas a seguir a 0 °C a 4 °C. Um banho de gelo poderia fornecer tais condições.
- Colha o sedimento celular após centrifugação a 356 x g a 4 ° C por 8 min. Remova o máximo de mídia possível, pois a tripsina restante prejudica o crescimento celular.
- Ressuspenda o sedimento com 3 mL de meio de neurônio suavemente. Certifique-se de que não são geradas bolhas de ar na solução que contém células para uma elevada taxa de sobrevivência.
- Filtrar o meio de mistura através de um filtro de células de 70 μm para um tubo de centrifugação de 50 ml.
- Mantenha o filtrado em uma coqueteleira a 30 rpm em banho de gelo por 30 min. Esta etapa não é necessária, mas recomendada.
- Colete as células por centrifugação a 356 x g a 4 ° C por 8 min e ressuspenda suavemente os grânulos celulares em 1 mL de meio de neurônio A.
- Adicione 500 μL de mistura de células em cada poço da placa de 48 poços preparada.
- Cultivar células em estufa a 37 °C e 5% de CO2.
- Substitua todos os meios por meios neurais B em 1 h para fornecer uma cultura livre de soro.
- Troque metade do meio neuronal B a cada 3 dias.
nota: Os neurônios estão prontos para experimentos imunocitoquímicos após 5 a 7 dias de cultura.
Tabela 1. Composição da solução de Krebs
| Ingredientes | Molaridade (mM) |
| NaCI | 120 |
| Kci | 5.9 |
| NaHCO3 | 25 |
| Na2HPO4·12H2O | 1.2 |
| MgCI2·6H2O | 1.2 |
| CaCI2 | 2.5 |
| glicose | 11.5 |
