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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Preparação e revestimento dos chips multicompartimentais
- Em um gabinete de biossegurança, coloque o chip em uma placa de Petri ou outro recipiente estéril adequado.
- Adicione 100 μL de solução de pré-revestimento ao poço superior esquerdo do cavaco e deixe-o fluir através do canal principal para o poço adjacente.
nota: A solução de pré-revestimento é usada para pré-revestir os canais microfluídicos para eliminar o potencial de aprisionamento de bolhas de ar dentro do chip.
- Encher o poço inferior esquerdo com 100 μL de solução de pré-revestimento. Aguarde 5 minutos para permitir que a solução flua através das microranhuras.
- Adicione 100 μL de solução de pré-revestimento ao poço superior direito e deixe-o fluir através do canal principal para o poço adjacente. Encha o poço inferior direito com 100 μL de solução de pré-revestimento.
- Aspire a solução de cada poço. Aspire longe dos canais principais para evitar a remoção de líquido dos canais principais (Figura 1A). Adicione imediatamente 150 μL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) no poço superior esquerdo. Aguarde 1,5 min.
cuidado: Não aspire todo o líquido dos canais principais fechados.
- Adicione 150 μL de PBS ao poço inferior esquerdo. Aguarde 5 minutos para permitir que os líquidos fluam através das microranhuras. Adicione 150 μL de PBS ao poço superior direito. Adicione 150 μL de PBS ao poço inferior direito. Aguarde 10 min.
- Repita as etapas 1.5-1.6 para uma segunda lavagem de PBS.
- Verifique o chip em um microscópio de cultura de tecidos para ver se há bolhas nos canais principais. Se houver bolhas, execute os procedimentos abaixo. Se não houver bolhas, pule para a etapa 1.9.
- Aspire o PBS dos poços, inclinando a ponta da pipeta para longe da abertura do canal (Figura 1A).
- Dispense 100 μL de solução de pré-revestimento no poço superior, inclinando a ponta da pipeta perto da abertura do canal (Figura 1B). As bolhas devem se mover através do canal para o poço inferior. Aguarde 1,5 min.
- Repita as etapas 1.3-1.8.
- Aspire o PBS dos poços, inclinando a ponta da pipeta para longe da abertura do canal (Figura 1A).
- Adicione 100 μL de 0,5 mg/mL de poli d-lisina (PDL) ao poço superior esquerdo do chip. Aguarde 1,5 min. Encha o poço inferior esquerdo com 100 μL de PDL.
- Adicione 100 μL de PDL ao poço superior direito do chip. Aguarde 1,5 min. Adicione 100 μL ao poço inferior direito.
- Fechar a placa de Petri e colocar a aparas numa incubadora a 37 °C durante 1 h.
- Repita as etapas de lavagem PBS 1.5-1.6 duas vezes para remover o excesso de PDL.
- Aspire o PBS do dispositivo.
- Adicione imediatamente 100 μL de meio de cultura de células no poço superior esquerdo do chip. Aguarde 1,5 min. Adicione mídia ao poço inferior esquerdo. Adicione mídia ao poço superior direito. Aguarde 1,5 min. Adicione 100 μL de meio ao poço inferior direito do chip.
- Coloque o chip na incubadora a 37 ° C até que esteja pronto para colocar as células em placas.
2. Semeando neurônios nos chips multicompartimentais
- Preparar a suspensão celular de neurônios dissociados do hipocampo de ratos de acordo com protocolos estabelecidos para produzir uma densidade de ~ 12 × 106 células / mL.
nota: É possível o uso de densidades de suspensão celular entre 3 e 12 × 106 células/mL. Se for utilizada uma densidade mais baixa, o volume de suspensão celular a adicionar à pastilha pode ser aumentado. O procedimento descrito abaixo é aplicável para neurônios corticais ou hipocampais dissociados murinos. As densidades celulares ideais para outros tipos de neurônios podem variar.
- Remova a maioria dos meios em cada poço do cavaco, deixando aproximadamente 5 μL em cada poço. Aspirar longe dos canais principais para evitar a remoção de líquido dos canais principais (Figura 1A).
cuidado: Não aspire líquidos dos canais principais fechados. Bolhas de ar podem ficar presas no chip se o fluido for aspirado dos canais principais.
- Carregue 5 μL de suspensão celular no poço superior direito e outros 5 μL de suspensão celular no poço inferior direito (~ 120.000 células no total). Carregue as células dispensando-as perto do canal principal (Figura 1B). Verifique ao microscópio se os neurônios estão no canal principal. Aguarde 5 min para permitir que as células se conectem.
nota: Os neurônios podem ser carregados em qualquer compartimento. Para fins de explicação, o compartimento somático é o canal principal do lado direito, mas qualquer um dos compartimentos pode ser usado como compartimento somático. É possível o uso de densidades celulares mais baixas de até 60.000 células por chip. Até 10 μL de suspensão celular podem ser adicionados a cada poço do compartimento somático em combinação com uma suspensão celular com menos células do que as descritas acima.
- Adicione aproximadamente 150 μL de meios de cultura neuronais a cada um dos poços superior e inferior direito e, em seguida, adicione 150 μL de meio a cada poço superior e inferior esquerdo. Coloque o chip na bandeja umidificada em uma incubadora de 5% CO2 37 °C.
- Após 24 h, execute uma mudança de mídia removendo a mídia dos poços. Certifique-se de que o canal principal permaneça preenchido. Adicione 150 μL de mídia a cada poço superior e, em seguida, preencha os poços inferiores.
- Coloque o chip de volta na incubadora pelo número desejado de dias.
nota: Monitore a mídia a cada poucos dias para garantir que ela permaneça rosa claro. Se o meio estiver amarelado, substitua 50% dele por meio novo. Se o nível do fluido estiver baixo, garantir umidade adequada e contenção secundária apropriada dos cavacos para evitar a evaporação. Minimizar ou eliminar as alterações de mídia é possível usando contenção secundária e/ou cobrindo o prato que contém o chip com filme de politetrafluoretileno (PTFE)-FEP.
